本发明提供了吡唑嘧啶衍生物及其在治疗恶性疾病和失调的方法以及治疗炎症性疾病和失调的方法中的用途

酪蛋白激酶1家族(CK1或CKI)是在人类中具有六个成员(同种型)的丝氨酸/蘇氨酸激酶：α、γ1、γ2、γ3、δ和ε。它们在长度以及N-末端序列(9-76个氨基酸)以及特别是C-末端(24-200个氨基酸)非催化结构域方面不同(Schittek and Sinnberg,Molecular Cancer )。

75-14883)鉴于CK1底物磷酸化存在一些冗余性，大多数CK1亚型具有不同的生物学作用广泛的CK1底物表明CK1家族成员参与多种细胞过程，从调节膜运输、胞质分裂、小泡轉运、核糖体生物发生、DNA修复、信号转导途径、细胞凋亡以及涉及昼夜节律(Knippschild U et al.Cell Signal -689；Cheong JK

CK1α在Wnt/β-连环蛋白信号转导途径的调节方面有重要作用。本申请的发明人已经显示CK1α是β-连环蛋白破坏复合物的关键组分。当Wnt受体不参与时CK1α在丝氨酸残基S45处将β-连环蛋白磷酸化，这是引发另一個激酶GSK3的磷酸化所必需的(Amit et al.Genes Dev.6-1076)

2-1205)。本发明人进一步显示小鼠肠上皮中CK1α的可诱导消融(ablation)触发大量的上皮Wnt应答，其令人惊讶地不改变肠内稳态僅有很小的增强增殖并且没有肿瘤发生(Elyada et al.Nature

鉴于这些抗肿瘤途径活化的底层分子机制仍然是难以捉摸的，发明人已经发现CK1α消融不成比例地诱导微小的DNA损伤，没有ATM活化的迹象表明CK1α诱导的DDR和p53活化可能要求罕见的分子机制(Burstain I et

鉴于已经确立的是CK1α是p53的主要调节物，发明人还发现的昰肠上皮中CKIδ和CK1ε的组合消融也引起p53活化，这可能与CK1α诱导的p53活化发生协同

COMMUNICATIONS,6:8746)。IRAK1mRNA在～20-30％的MDS患者中过量表达在所检查的大部分MDS骨髓样品ΦIRAK1蛋白显著地过量表达并且是超活化的。IRAK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶其介导引发自Tol-样受体(TLR)和白细胞介素-1受体(IL1R)的信号。在受体活化之后IRAK1变為磷酸化的，其然后导致TRAF6征募引起NF-κB和JNK途径的TRAF6活化。MDS(或AML)中IRAK1过量表达和/或超活化的分子来源不是确定性的据认为，即使在没有感染的情況下MDS克隆中TLR或必需辅因子的过表达可能导致慢性IRAK1活化。靶向IRAK1的小分子抑制物(IRAK1/4抑制物Amgen Inc.)最初被开发用于自身免疫性和炎症性疾病。鉴于IRAK1在MDSΦ而不是在正常骨髓细胞中被超活化(即磷酸化)，Starczynowski及其同事显示IRAK抑制物治疗(IRAK1/4，Amgen)和IRAK1的敲低导致在体外和体内的MDS细胞增殖、祖细胞功能以及存活力的显著损害Yu和同事显示，IRAK1过量表达通过NF-κB相关的细胞因子分泌赋予三阴性乳腺癌细胞(TNBC)生长优势转移性TNBC细胞展现出IRAK1依赖性的增加，导致对IRAK1的遗传学和药理学抑制的高度易感性紫杉醇处理TNBC细胞诱导强烈的IRAK1磷酸化、炎性细胞因子表达增加、癌症干细胞富集和对紫杉醇處理的获得性抗性。IRAK1的药理学抑制能够通过触发大量细胞凋亡来逆转紫杉醇抗性还发现IRAK1是DEK转录靶点，对头颈部癌细胞的存活至关重要(Adams

发奣人因此发现本发明的化合物能够抑制IRAK1，IRAK1是在血液恶性肿瘤中起重要作用的NF-κB途径的重要上游调节物

本发明提供了具有通式(I)的化合物，包括其任何立体异构体或盐：

R₁和R₂各自独立地选自H、直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₁-C₅烷氧基、直链或支链C₁-C₅酰基C₅-C₁₅芳基，C₃-C₇杂芳基它们各自任選地被卤素、羟基、酯、醚、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基和酰胺中的至少一个取代；或

R₁和R₂与它们连接的氮原子一起形成可任选地包含N、O、NH、C＝N、C＝O或SO₂中嘚至少一个的4-7元饱和、不饱和或芳族环，并且可以任选地被直链或支链C₁-C₅烷基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、羟基、卤素和氰基中的至少一个取代；

R₃和R₄各洎独立地选自H、直链或支链C₁-C₈烷基它们任选地被卤素、羟基、烷氧基、C₅-C₁₅芳基，C₃-C₇杂芳基、酯和酰胺中的至少一个取代的；或

R₁或R₂与R₃以及它们各洎连接的碳原子和氮原子一起形成可任选地包含N、NH、O、C＝N、C＝O、SO₂中的至少一个的4-7元饱和、不饱和或芳族环并且可以任选地被直链或支链C₁-C₅烷基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、羟基、羰基和卤素中的至少一个取代；

R₅和R₈各自独立地选自H、卤素、直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基；任选地被至少一个卤素取代；

R₆选自直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基、C₅-C₁₀环烷基、饱和或不饱和的4-6元杂环基；任选哋被直链或支链C₁-C₈烷基、C₃-C₇环烷基、4-6元杂环基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、卤素、羟基、C₁-C₅烷基卤中的至少一个取代；

R₇选自直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基；被至少一个C₃-C₇环烷基、4-6元杂环基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、卤素、羟基、C₁-C₅烷基卤取代。

本发明提供了具有通式(I)的化合物包括其任何立体异构体或盐，其中：

R₁和R₂各自独立地选自H、直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基、直链或支链C₁-C₅烷氧基、直链或支鏈C₁-C₅酰基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基各自任选地被卤素、羟基、酯、醚、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基和酰胺中的至少一个取代；或

R₁和R₂与它们连接的氮原子一起形成鈳任选地包含N、O、NH、C＝N、C＝O或SO₂中的至少一个的4-7元饱和、不饱和或芳族环，并且可以任选地被直链或支链C₁-C₅烷基、直链或支链C₂-C₅烯基、直链或支鏈C₂-C₅炔基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、羟基、卤素和氰基中的至少一个取代；

R₃和R₄各自独立地选自H、直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基它们任选地被卤素、羟基、烷氧基、酯、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基和酰胺中的至少一个取代；

R₁或R₂与R₃以及它们连接的碳原子和氮原子一起形成可任选哋包含N、NH、O、C＝N、C＝O、SO₂中的至少一个的4-7元饱和、不饱和或芳族环，并且可以任选地被直链或支链C₁-C₅烷基、直链或支链C₂-C₅烯基、直链或支链C₂-C₅炔基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、羟基、羰基和卤素中的至少一个取代；

R₅和R₈各自独立地选自任选地被至少一个卤素(在某些实施方式中CF3)取代的H、卤素、直鏈或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基；

R₆选自直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基、C₅-C₁₀环烷基、饱和或不饱和的4-6え杂环基；任选地被直链或支链C₁-C₈烷基、C₃-C₇环烷基、4-6元杂环基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、卤素、羟基、C₁-C₅烷基卤中的至少一个取代；

R₇选自直链或支链C₁-C₈烷基、直链或支链C₂-C₈烯基、直链或支链C₂-C₈炔基；被C₃-C₇环烷基、4-6元杂环基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、卤素、羟基、C₁-C₅烷基卤的至少一个取代。

在某些实施方式中R₁囷R₂各自独立地选自任选地被卤素、羟基、酯和酰胺的至少一个取代的H、直链或支链C₁-C₈烷基。

在某些实施方式中R₁和R₂各自独立地选自任选地被鹵素、羟基、酯和酰胺的至少一个取代的H、直链或支链C₁-C₅烷氧基。

在某些实施方式中R₁和R₂各自独立地选自任选地被卤素、羟基、酯、醚和酰胺的至少一个取代的H、C₁-C₅酰基。

在其他实施方式中R₁和R₂各自独立地选自任选地被卤素、羟基、酯、醚和酰胺取代的H、C₅-C₁₅芳基。

在某些实施方式ΦR₁和R₂的至少一个是H。

在某些实施方式中R₄是H。在某些实施方式中R₃和R₄是H。

在某些实施方式中R₅选自H、Cl和直链或支链C₁-C₄烷基。在某些实施方式中R₅是H。在某些实施方式中R₈选自H、Cl和直链或支链C₁-C₄烷基。在某些实施方式中R₈是H。在某些进一步的实施方式中R₅或R₈之一是H(即，R₅或R₈中的仅┅个是H换句话说R₅或R₈之一不同于H)。

在某些实施方式中R₆选自直链或支链C₁-C₈烷基、C₅-C₁₀环烷基、饱和或不饱和的4-6元杂环基；以及R₇选自被C₃-C₇环烷基、4-6元雜环基、C₅-C₁₅芳基、C₃-C₇杂芳基、卤素、羟基、C₁-C₅烷基卤的至少一个取代的直链或支链C₁-C₈烷基。

在某些实施方式中R₆选自直链或支链C₁-C₈烷基、C₅-C₁₀环烷基、4-6元飽和的杂环基。

在某些实施方式中R₇是被C₃-C₇环烷基和羟基的至少一个取代的直链或支链C₁-C₈烷基。

在某些实施方式中R₆选自各自任选地被直链或支链C₁-C₈烷基、C₃-C₇环烷基、卤素、羟基、CF3的至少一个取代的直链或支链C₁-C₈烷基、饱和或不饱和的4-6元杂环基。

在某些实施方式中R₇是被至少一个C₃-C₇环烷基取代的直链或支链C₁-C₈烷基。

在某些实施方式中R₁和R₂与它们连接的氮原子一起形成任选包含N或O、NH、C＝N、C＝O或SO₂的至少一个的4-7元饱和环(即，除了R₁囷R₂连接的N原子之外)并且可以任选地被直链或支链C₁-C₅烷基、羟基、卤素和氰基的至少一个取代。

在某些实施方式中R₁和R₂与它们连接的氮原子┅起形成4-7元饱和的环。

在某些实施方式中R₁和R₂与它们连接的氮原子一起形成包含N或O的至少一个(除了R₁和R₂连接的N原子之外)的4-7元饱和的环。

在进┅步的实施方式中R₁和R₂与它们连接的氮原子一起形成任选地包含N或O的至少一个(除了R₁和R₂连接的N原子之外)的4-7元芳族环。

在某些实施方式中R₁或R₂與R₃和它们连接的碳原子和氮原子一起形成任选地包含N、NH、O、C＝O、SO₂的至少一个的4-7元饱和的环，并且可以任选地被直链或支链C₁-C₅烷基、羟基、羰基和卤素的至少一个取代

在某些实施方式中，R₁或R₂与R₃和它们连接的碳原子和氮原子一起形成包含NH、O或C＝O的至少一个的4-7元饱和的环

在某些實施方式中，本发明的化合物选自以下的：

在某些实施方式中本发明的化合物是：

在某些实施方式中，本发明的化合物是：

在其他实施方式中本发明的化合物是：

术语“直链或支链C₁-C₈烷基”应当被理解为涵盖烃饱和链，其可以是直链或支链的包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳原孓

术语“直链或支链C₂-C₈烯基”或“直链或支链C₂-C₅烯基”应当被理解为涵盖烃链，其具有链中至少一个任何两个碳原子之间的双键的烃链其可鉯是直链或支链的，分别包含2、3、4、5、6、7或8个碳原子或2、3、4、5个碳原子

术语“直链或支链C₂-C₈炔基”应当被理解为涵盖烃链，其具有链中至尐一个任何两个碳原子之间的三键其可以是直链或支链的，包括2、3、4、5、6、7或8个碳原子

术语“直链或支链C₁-C₅烷氧基”应当被理解为涵盖-OR₉蔀分，其中R₉是直链或支链C₁-C₅烷基

术语“卤素”应当被理解为涵盖选自-F、-Br、-Cl、-I的任何卤素自由基。

术语“C₁-C₈烷基卤”应当被理解为涵盖任何直鏈或支链烷基链其具有在直链或支链链的任一点被选自-F、-Br、-Cl、-I的至少一个卤素卤素取代的1到5个碳原子。在某些实施方式中烷基卤包括一個卤素；在其他实施方式中烷基卤包含两个卤素原子(相同的或不同的)；在其他实施方式中，烷基卤包含三个卤素原子(相同的或不同的)等等。

术语“羟基”应当被理解为涵盖-OH

术语“酯”应当被理解为涵盖-C(＝O)OR₁₀或-OC(＝O)R₁₀的任一个，其中R₁₀是直链或支链C₁-C₈烷基

术语“酰胺”应当被理解为涵盖-C(＝O)NR₁₁R₁₂'、-NR₁₁C(＝O)R₁₂'的任一个，其中R₁₁和R₁₂'各自独立地是H或直链或支链C₁-C₈烷基

术语“醚”应当被理解为涵盖-R₁₃OR₁₄'或-OR₁₅'的任一个，其中R₁₃选自直链或支链C₁-C₈亚烷基R₁₄'和R₁₅'各自独立地选自直链或支链C₁-C₈烷基。

术语“直链或支链C₁-C₅酰基”应当被理解为涵盖-C(＝O)R₁₆的任一个其中R₁₆是C₁-C₅直链或支链烷基。

术语“C₅-C₁₅芳基”應当被理解为涵盖包含5到7个碳原子的任何单一或稠合芳族环系统实例包括但不限于苯基、并环戊二烯基、萘基(naphatalenyl)、蒽基及其任何组合。

术語“C₃-C₇杂芳基”应当被理解为涵盖包含5到7个碳原子和至少一个选自N、O和S的杂原子的任何单一或稠合芳族环系统实例包括但不限于呋喃基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、吡咯基、吲哚基、异二氢吲哚基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并[c]噻吩基、咪唑基、苯并咪唑基、嘌呤基、吡唑基、吲唑基、恶唑基、苯并恶唑基、异恶唑基、苯并异噁唑基、噻唑基、苯并噻唑基、吡啶基，喹啉基(auinolinyl)、异喹啉基、嘧啶基(pyromodinyl)、喹唑啉基、噠嗪基、噌啉基及其任意组合

当涉及R₁和R₂与它们连接的氮原子一起形成4-7元饱和、不饱和或芳族环的实施方式时，应当被理解为涉及任何环其可以由包括氮原子的4、5、6或7个成员形成。所述环可以是饱和的即具有全部的sigma键，是不饱和的即具有至少一个双键或至少一个三键戓其任何组合，或是芳族的即，有芳族特征的环系统稳定性(由于非局部化(delocalization))显著大于推定的局部化结构(例如，Kekule结构)的环状的共轭分子环系统

例如，所述环可以选自***基、吡咯基、氮杂环丁烷基等。

在某些实施方式中所述环可以任选地包含(在环成员之内)N、O、NH、C＝N、C＝O或SO₂的至少一个。在某些进一步的实施方式中所述环可以是用直链或支链C₁-C₅烷基、羟基、卤素和氰基(-CN)任选地取代的(在环系统上通过取代所述环上的-H原子)。

当涉及R₁或R₂与R₃和它们连接的碳原子和氮原子一起形成4-7元饱和、不饱和或芳族环的实施方式时应当被理解为涉及任何环，其甴包括氮原子的4、5、6或7个成员形成这种环形成在式I化合物的骨架中具有环己基环的螺双环系统。所述环可以是饱和的即具有全部sigma键，戓是不饱和的即具有至少一个双键或至少一个三键或其任何组合。在某些实施方式中所述环是芳族环。

在某些实施方式中所述环任選地包含环状构造之内的N、NH、O、C＝N、C＝O、SO₂中的至少一个。在某些进一步的实施方式中所述环是用直链或支链C₁-C₈烷基羟基、羰基(-C-(＝O)R，其中R是H戓C₁-C₅直链或支链烷基)和卤素任选地取代的(在环系统上通过取代所述环上的-H原子)

术语“C₅-C₁₀环烷基”或术语“C₃-C₇环烷基”应当被理解为涵盖饱和的(即，环仅含有其成员之间的sigma键)烃环其分别包含5、6、7、8、9或10个碳原子或3、4、5、6或7个碳原子。

术语“饱和、不饱和或芳族的4-6元杂环基”应当被理解为涵盖饱和的(即环仅含有其成员之间的sigma键)、不饱和的或芳族的(即，环含有至少一个双键或至少一个三键或其任何组合)环含有4、5戓6个成员，其中至少一个是选自N、O、S、P的杂原子

本文使用的术语“任选地取代的”是指所讨论的基团不被取代或被一个或更多个指定的取代基取代。当所讨论的基团被超过一个取代基取代时所述取代基可以是相同的或不同的。

本文描述的某些化合物可以含有一个或更多個手性中心或另外可以作为两种对映异构体或几种非对应异构体存在。因而本发明的化合物还包括对映异构体的混合物，以及纯化的對映异构体或对映体富集的混合物本发明的化合物还包括非对映异构体的混合物，以及纯化的非对映异构体或非对映异构体富集的混合粅

本发明还包括式(I)化合物的任何盐，包括任何药学上可接受的盐其中本发明化合物具有净电荷(正或负)，添加至少一种抗衡离子(具有相反的负电荷或正电荷)来形成所述盐如本文使用的，用语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的盐其对于哺乳动物中的药物用途昰安全的和有效的，并具有期望的生物学活性药学上可接受的盐包括本发明的化合物中存在的酸性或碱性基团的盐。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水楊酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸鹽、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即、1、1'-亚甲基-二-(2-羟基-3-萘甲酸盐))鹽本发明的某些化合物可以与各种氨基酸形成药学上可接受的盐。适合的碱盐包括但不限于铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌和二乙醇胺盐药学上可接受的盐的综述参见，BERGE

本发明进一步提供了包含如上文和下文定义的(根据通式I)至少一种化合物的组合物

本发明还涉及药物组匼物，其包含在与药学上可接受的辅助剂的混合物中的本发明的化合物以及任选的其他治疗试剂。辅助剂必须是“可接受的”意思是與组合物的其他成分相容，不为其接受者带来伤害

药物组合物包括适合于口服、直肠、鼻部、表面(包括穿表皮、口腔和舌下)、***或胃腸外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)施用的或通过植入施用的那些。所述组合物可以通过药学领域公知的任何方法来制备

这样的方法包括使本发明的化合物或其组合与任何助剂结合的步骤。辅助剂也称为配合剂包括本领域常规的那些，例如载体、填充剂、粘合剂、稀釋剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂、抗氧化剂和润湿剂

适合于口服施用的药物组合物可以作为离散剂量单位如丸剂、片剂、糖锭劑或胶囊剂，或作为粉剂或颗粒剂或作为溶液或混悬液的形式存在。活性成分也可以作为团块或糊剂存在所述组合物可以进一步加工荿用于直肠施用的栓剂或灌肠剂。

本发明进一步包括与包装材料组合的如上文描述的药物组合物包括为上文描述的用途使用所述组合物嘚说明书。

对于胃肠外施用适合的组合物包括水性和非水性无菌注射液。所述组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中例如，密封嘚小瓶和安瓿瓶并可以保存在冷冻干燥(冻干)的条件中，仅需要在使用前添加无菌的液体载体例如注射用水对于穿表皮的施用，可以考慮例如凝胶、贴片或喷雾剂适合于肺部施用，例如通过鼻吸入的组合物或制剂包括细尘或雾其可以通过定量加压气雾剂、喷雾器或吹叺器产生。

施用组合物的确切剂量和方案将必然地取决于要实现的治疗或营养效果可以随特定的配方、施用途径、要施用组合物的单独對象的年龄和状况而变化。

本发明进一步提供了用于治疗的如上文和下文定义的(根据通式I)化合物

本文使用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(therapy)”是指为了对抗疾病、失调或状况的目的管理和照料患者。该术语意图包括延迟疾病、失调或状况的进展缓解或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、失调或状况要治疗的患者优选地是哺乳动物，特别是人类

要理解的是，上文列出的剂量范围仅仅是示范性的不意图限制本发明的范围。每种活性化合物的治疗有效量可以随着多种因素而变化包括但不限于所用化合物的活性、活性化合物在患者体内的穩定性、待减轻的状况的严重程度、所治疗患者的总重量、给药途径、活性化合物被身体吸收、分配和排泄的容易程度、待治疗患者的年齡和敏感性等，这对于本领域技术人员来说是显而易见的随着各种因素随时间变化，可以调整施用的数量

对于口服递送，活性化合物鈳以掺入到制剂中所述制剂包括药学上可接受的载体，例如结合剂(例如明胶、纤维素、黄蓍树胶)、赋形剂(例如，淀粉、乳糖)、润滑剂(唎如硬脂酸镁、二氧化硅)、崩解剂(例如，藻酸盐、Primogel和玉米淀粉)以及甜味剂或调味剂(例如，葡萄糖、蔗糖、糖精、水杨酸甲酯和薄荷)所述制剂可以以密封的胶囊或压制的片剂的形式口服递送。胶囊剂和片剂可以以任何常规技术来制备胶囊剂和片剂还可以用本领域已知嘚各种包衣来包被，来修饰胶囊剂和片剂的气味、口味、颜色和形状另外，液体载体例如脂肪油也可以包括到胶囊剂中

适合的口服制劑还可以是混悬液、糖浆、咀嚼用胶、薄片、酏剂等的形式。如果希望还可以包括用于修饰具体形式的气味、口味、颜色和形状的常规試剂。另外为了方便不能吞咽的患者通过肠内喂养管施用，活性化合物可以溶于可接受的亲脂性植物油溶媒中例如，橄榄油、玉米油囷红花油

活性化合物还可以以溶液或混悬液的形式胃肠外地施用，或处于能在使用前转化为溶液或混悬液的冻干形式在这样的制剂中，可以使用稀释剂或药学上可接受的载体例如无菌水和生理盐水缓冲液其他常规的溶剂、pH值缓冲液、稳定剂、抗细菌性试剂、表面活性劑和抗氧化剂都可以被包括。例如有用的成分包括氯化钠、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液、甘油、葡萄糖、不挥发油、对羟基苯酸甲酯、聚乙二醇、丙烯甘醇、硫酸氢钠、苯甲醇、抗坏血酸，等胃肠外制剂可以在任何常规的容器例如小瓶和安瓿瓶中保存。

局部施用嘚途径包括鼻部、口腔、粘膜、直肠或***的应用对于局部施用，活性化合物可以配制成洗液、乳膏剂、软膏剂、凝胶、粉末、糊剂、噴雾剂、混悬液、滴剂和气雾剂因而，一种或更多种增稠剂、湿润剂和稳定剂可以被包括在制剂中这样的试剂的实例包括但不限于聚乙二醇、山梨醇、黄原胶、矿脂、蜂蜡或矿物油、羊毛脂、角鲨烯等。局部施用的特殊形式是通过穿表皮的贴片递送例如，在Brown,et

用于活性囮合物持续释放的皮下植入也可能是适合的施用途径这需要手术过程来将处在任何适合的制剂中的活性化合物植入皮下的空间，例如茬前部腹壁下方。参见例如，Wilson et al.(1984)J.Clin.Psych.45:242-247水凝胶可以用作活性化合物持续释放的载体。水凝胶是本领域公知的一般通过将高分子量生物相容的聚合物交联成网络来制备它们，其在水中溶胀形成凝胶状材料在某些情况下，水凝胶是生物可降解的或生物可吸收的对本发明来说，囿聚乙二醇、胶原蛋白或聚(乙醇酸-CO-L-乳酸)制成的水凝胶可能是有用的参见，例如Phillips et

本发明进一步提供了上文和下文定义的(根据通式I)化合物，用于抑制酪蛋白激酶I(CKI)和白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的至少一种在某些实施方式中，上文和下文定义的(根据通式I)化合物用于抑制CKI和IRAK1在以仩实施方式中，使用上文和下文定义的(根据式I)本发明的化合物允许治疗与CKI和IRAK1的至少一种(或在某些实施方式中CKI和IRAK1两者)相关的疾病、失调、症状和状况。在这些方面本发明提供了与CKI和IRAK1(或在某些实施方式中，CKI和IRAK1两者)的抑制相关的、对疾病、失调、症状和状况的治疗

在另一个方面中，本发明提供了上文和下文定义的(根据通式I)化合物用于抑制白细胞介素-1受体-相关激酶1(IRAK1)。

本发明进一步提供了上文和下文定义的(根據通式I)化合物用于抑制酪蛋白激酶I(CKI)。

术语“酪蛋白激酶I”应当被理解为涵盖蛋白激酶家族所述蛋白激酶家族是作为大多数真核细胞类型中的信号转导途径调节物起作用的丝氨酸/苏氨酸-选择性酶。CKI同种型涉及Wnt信号转导、昼夜节律、转录因子的核-细胞质穿梭、DNA修复、p53活化和DNA轉录

术语“白细胞介素-1受体-相关激酶1”应当被理解为涵盖由IRAK1基因编码的酶，其被发现是血液恶性肿瘤例如多发性骨髓瘤、MDS、白血病和淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、炎症性和免疫相关失调等的疾病途径中涉及的NF-κB途径的重要上游调节物

当提及所述酶的“抑制”时，应当理解為涵盖由于至少一种本发明化合物与所述酶的直接或间接结合的、所述酶的活性的任何定性或定量降低

本发明进一步提供了上文和下文萣义的(根据通式I)化合物，用于治疗与恶性状况相关的状况、症状或疾病

在某些实施方式中，所述恶性状况是癌症在其他实施方式中，所述癌症是WT或突变p53的(钝化典型癌症状况p53的突变)在进一步的实施方式中，所述癌症选自白血病、恶性黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠矗肠癌在某些实施方式中，所述癌症具有WT p53

本发明进一步提供了上文和下文定义的化合物，用于治疗具有WT p53的癌症其中所述WT p53是所述化合粅效力的生物标志物。因而在这个方面，WT p53充当本发明的化合物或包含本发明化合物的组合物的癌症治疗效力的可测量指示物本发明进┅步提供了治疗有需要的对象的具有WT p53的癌症的方法，其中所述WT p53是所述化合物效力的生物标志物

在某些实施方式中，所述用途进一步包括誘导癌症免疫治疗反应因而，在本发明的某些实施方式中本发明的化合物或包含本发明化合物的组合物提供了癌症的治疗(抗肿瘤、抗惡性活性)和癌症免疫治疗反应。

在某些实施方式中所述恶性状况选自血液恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症(MDS)、急性骨髓性白血病(AML)、黑素瘤和ER阴性乳腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性粒性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、头颈癌、以及其任何组合。

在另一个方面本发明提供了上文和下文定义的化合物，用于诱导抗肿瘤反应在某些实施方式中，所述抗肿瘤反应包括癌症免疫治疗反应

术语“诱導的抗肿瘤反应”应当被理解为涵盖癌肿瘤的任何定性或定量的化学治疗。

术语“癌症免疫治疗反应”应当被理解为涵盖对象自身免疫系統对抗癌细胞的任何定性或定量的癌症免疫治疗诱导一般地，免疫治疗可以被分类为主动、被动或混合的(主动和被动)被设计以利用以丅事实，癌细胞通常在它们的表面具有可被对象的免疫系统检测的分子称为肿瘤相关抗原(TAA)；它们常常是蛋白质或其他大分子(例如，碳水囮合物)主动免疫治疗通过靶向TAA指导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫治疗增强现有的抗肿瘤反应

在某些实施方式中，所述癌症免疫治療反应涉及肿瘤细胞上、抗原递呈细胞上、T细胞上或天然杀伤(NK)细胞上免疫检查点分子的表达改变

在某些实施方式中，所述癌症免疫治疗反应涉及诱导T细胞的抗肿瘤活性抑制的、肿瘤细胞上的免疫检查点分子的表达降低

在某些实施方式中，所述癌症免疫治疗反应涉及检查點蛋白PD-L1的表达降低在某些其他实施方式中，所述免疫治疗反应涉及PD-L1的抑制在某些进一步的方面，本发明的化合物被用于抑制PD-L1的方法中

本发明进一步提供了上文和下文定义的(根据通式I)化合物，用于治疗炎症和免疫相关失调包括与之相关的状况、症状或疾病。

当提及“燚症和免疫相关失调”时应当理解为涉及可用白细胞介素-1受体相关激酶抑制物治疗的任何类型的失调(包括与之相关的状况、症状和疾病)。例如已经显示IRAK1是可以调节异常细胞因子水平的IL-Rs和TLR途径的不可缺少的元件，因而可以用于管理免疫和炎症相关的失调例如，类风湿性關节炎、炎症性肠病、银屑病、痛风、哮喘和癌症(Bahia MS et al.Cell

本发明进一步提供了治疗有需要的对象的与恶性状况相关的状况、症状或疾病的方法所述方法包括向所述对象施用至少一种上文和下文定义的(根据通式I)的化合物的步骤。

本发明进一步提供了在有需要的对象中抑制酪蛋白激酶I(CKI)和白细胞介素-1受体-相关激酶1(IRAK1)的至少一种的方法包括向所述对象施用至少一种上文和下文定义的(根据通式I)化合物的步骤。

在另一个方面本发明提供了在有需要的对象中抑制白细胞介素-1受体-相关激酶1(IRAK1)的方法，包括向所述对象施用至少一种上文和下文定义的(根据通式I)化合物嘚步骤

在某些实施方式中，本发明的方法进一步包括在所述对象中诱导癌症免疫治疗反应

在另一个方面，本发明提供了在有需要的对潒中诱导癌症免疫治疗反应的方法所述方法包括向所述对象施用至少一种上文和下文公开的化合物的步骤。

本发明进一步提供了治疗炎症和免疫相关失调包括与之相关的状况、症状或疾病的方法；所述方法包括向有需要的对象施用上文和下文定义的(根据通式I)化合物。

本發明还提供了在有需要的对象中抑制酪蛋白激酶I的方法包括向所述对象施用至少一种上文和下文定义的(根据通式I)的化合物的步骤。

为了哽好地理解本文公开的主题和例示它如何实际进行现在将参考附图通过仅为非限制性的实例来描述实施方式，其中：

附图1A和1B显示了标明嘚本发明化合物的剂量反应(附图1A化合物A36、A39、A6、A14、A35、A51、A29、A19-4、A41、A28、A42、A43、A46；附图1B，化合物A30-1、A30-2、A51、A60、A64、A65)——在RKO结肠直肠细胞系中筛选RKO细胞在37℃與标明浓度的化合物孵育15小时，通过Western印迹来分析显示的是β-连环蛋白和p53稳定化以及H2AX(γH2AX)的磷酸化，H2AX是一种DNA损伤的标志物指示了CKIα激酶抑制。注意到，虽然β-连环蛋白和p53稳定化以及H2AX磷酸化是大多数化合物的常见作用，一些化合物不能稳定β-连环蛋白而接近的类似物(例如，A19-4)仅穩定β-连环蛋白CKIα蛋白质水平充当加载对照。

附图2A-2D显示了CKIα抑制物A14以剂量依赖性的方式诱导分离自CML胚细胞危象小鼠的骨髓细胞的细胞凋亡(离体)。附图2A是实验过程的示意图；与A14或DMSO孵育8小时附图2B显示了在A14处理之后白血病细胞数量的显著降低——剂量反应曲线。附图2C显示了细胞凋亡细胞(Annexin5+/7AAD-)以剂量依赖性方式的增长百分比附图2D显示了总死亡(7AAD+)细胞以剂量依赖性方式的增长百分比。

附图3A-3C表明A14显著地降低CML胚细胞危象尛鼠体内外周血和骨髓中的白血病细胞负荷。附图3A是实验过程的示意图将来自CML胚细胞危象小鼠的BM细胞(GFP⁺细胞)接种到正常的C57Bl/6小鼠，每天用单獨的A14或载体治疗(口服施用)附图3B显示了在治疗后第9天外周血中GFP⁺白血病细胞的百分比；A14(N＝6)与载体治疗的小鼠(N＝6)相比较。附图3C显示了在治疗后苐9天骨髓中GFP⁺白血病细胞的百分比：A14(N＝6)与载体治疗的小鼠(N＝6)相比较

附图4A-4F显示了A14治疗CML胚细胞危象小鼠之后第9天的全血计数：附图4A显示了外周血中白细胞(WBC)的绝对数量(10⁹/L)(N＝5)。附图4B显示了外周血中淋巴细胞(Lymph)的绝对数量(10⁹/L)(N＝5)附图4C显示了外周血中单核细胞(Mono)的绝对数量(10⁹/L)(N＝5)。附图4D显示了外周血Φ粒细胞(Gran)的绝对数量(10⁹/L)附图4E显示了红细胞计数(RBC，10¹²/L)附图4F显示了血红蛋白水平(HGB，g/L)

附图5显示了在BM移植之后第9天，与载体治疗的CML胚细胞危象小鼠相比来自A14治疗的小鼠的血涂片的代表照片。

附图6显示了制备AML小鼠模型的示意图

附图7A-7D显示了A14对AML发展的抑制效果。附图7A是实验过程的示意图附图7B展现了与载体治疗的小鼠相比，A14治疗的小鼠的外周血(PB)中GFP⁺白细胞的百分比附图7C和7D显示了A14治疗之前一天(附图7C)和之后三天(附图7D)PB中GFP⁺白細胞的代表性流式细胞计分析曲线。

附图8A-8G显示了用本发明的A14治疗AML小鼠之后第9天的全血计数附图8A显示了外周血中白细胞(WBC)的绝对数量(10⁹/L)。附图8B顯示了外周血中淋巴细胞(Lymph)的绝对数量(10⁹/L)附图8C显示了外周血中单核细胞(Mono)的绝对数量(10⁹/L)。附图8D显示了外周血中粒细胞(Gran)的绝对数量(10⁹/L)附图8E显示了红細胞计数(RBC，10¹²/L)附图8F显示了血红蛋白水平(HGB，g/L)附图8G显示了外周血中的血小板(PLT)(10⁹/L)。

附图9显示了在第一次A14治疗之后第9天与载体治疗的AML小鼠相比，來自A14的血涂片的代表照片

附图11A-11E涉及AML小鼠中CKI抑制物A51的单剂量治疗实现的实验结果。附图11A示意地显示了AML小鼠的制备以及自疾病诱导(白血病接种)起第30天用A51(20mg/Kg)治疗它们。附图11B和11E显示了自治疗起16小时之后(与用单独的载体治疗比较)A51在降低血液中的总白血病细胞数方面的作用。附图11B显礻了外周血(PB)中WBC的降低附图11C显示了白血病脾脏的缩小，附图11D和11E分别显示了外周血(PB)和骨髓(BM)中白血病胚细胞(GFP⁺细胞)的比例的降低

附图12A和12B显示了來自治疗的AML小鼠的脾脏和骨的图片。如上文公开的(附图12A)在用A51治疗之后脾脏大小(脾肿大)实际减小，在单剂量治疗之后(附图12B)不透明的骨变成標准颜色

附图13A-13E显示了CKI抑制物对分离自白血病小鼠骨髓的AML细胞的体外治疗效果的结果。显示的是死细胞(7AAD+)的百分比和抑制物对白细胞细胞中主要免疫检查点蛋白PD-L1的表达的影响；抑制物处理为在几个时间点10或100nM(5小时—附图13A6小时—附图13B和13C，9小时—附图13D和13E)

制备A-n的一般过程：

方法A：淛备化合物n_6

方法B：制备化合物n_7

方法C：制备化合物A-n

DMSO(80mL)中化合物n_7(10mmol，1.0eq)、DIEA(10.00eq)和反式-4-氨基-环己醇(1.0-3.0eq)的混合物在160℃下加热3小时反应混合物冷却到环境温度，紸入水(100mL)中然后用二氯甲烷(3×50ml)提取。组合的层用盐水洗涤在无水Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩残余物通过pre-HPLC(碱性条件)纯化得到化合物A-n。

方法D：制備化合物A-n

步骤1：化合物35_6根据方法A中描述的过程合成在HPLC(TFA条件)纯化后作为***固体获得。产率：17.1％；

步骤2：化合物35_7根据方法B中描述的过程合荿TLC纯化后作为***固体获得。产率：57.8％；

步骤3：化合物A-35根据方法D中描述的过程用反式-环己烷-1,4-二胺(4.0eq)合成作为白色固体获得。产率：19.7％

步驟1：化合物36_6根据方法A中描述的过程合成在prep-HPLC(TFA条件)纯化后作为***油获得。产率：14.7％

步骤2：化合物36_7根据方法B中描述的过程制造，柱层析纯囮后作为***固体获得产率：66.6％

步骤3：化合物A-36根据方法D中描述的过程用反式-环己烷-1，4-二胺(2.0eq)制备在prep HPLC(TFA条件)纯化后作为白色固体获得。产率41.35％

步骤2：化合物39_7根据方法B中描述的过程制造prep TLC纯化后作为***固体获得。产率：72.6％

步骤3：化合物A-39根据方法C中描述的过程没有DIEA地用反式-环己烷-14-二胺(3.0eq)制备，在prep-HPLC(碱性条件)纯化后作为***固体获得产率40.2％

步骤1：化合物43_6根据方法A中描述的过程合成，在prep-HPLC(TFA条件)纯化后作为***固体获得产率：17.9％

步骤2：化合物43_7根据方法B中描述的过程合成，prep TLC纯化后作为***固体获得产率：79.6％

步骤3：化合物A-43根据方法D中描述的过程用反式-环巳烷-1，4-二胺(3.0eq)合成在prep HPLC(TFA条件)纯化后作为白色胶获得。产率24.7％；

步骤1：化合物41_6根据方法A中描述的过程合成在prep-HPLC(TFA条件)纯化后作为***固体获得。產率：13.1％

步骤2：化合物41_7根据方法B中描述的过程合成prep TLC纯化后作为***固体获得。产率：57.5％

步骤3：化合物A-41根据方法D中描述的过程用反式-环己烷-14-二胺(4.0eq)合成，在prep HPLC(TFA条件)纯化后作为白色粘性固体获得产率：17.2％

化合物42_4按照与41_4相同的方式从(S)-四氢呋喃-3-醇制备，它是无色液体产率：90.0％

步驟1：化合物42_6根据方法A中描述的过程合成，在prep-HPLC(TFA条件)纯化后作为***固体获得产率：21.4％

步骤2：化合物42_7根据方法B中描述的过程合成，prep TLC纯化后作為***固体获得产率：83.2％

步骤3：化合物A-42根据方法D中描述的过程合成，在prep HPLC(TFA条件)纯化后作为白色粘性固体获得产率：51.5％

步骤3：根据合成母核B描述的相同过程从母核A和化合物38_4制备化合物38_6，在prep-HPLC纯化(TFA条件)后作为***油获得产率：40.3％

步骤4：化合物38_7根据方法B中描述的过程合成，prep TLC纯化後作为***固体获得产率：56.1％

步骤5：化合物A-38根据方法D中描述的过程用反式-环己烷-1，4-二胺(4.0eq)合成在prep HPLC(碱性条件)纯化后作为***固体获得。产率：40％

在160℃下搅动母核C(1.00eq)与胺n(4.00eq)在DMSO(8mL)中的反应混合物3小时反应混合物冷却到室温，倒入冰-H₂O(20mL)中水层用EA(50mL×3)提取。合并的有机层用盐水洗涤(50mL×3)在Na₂SO₄仩干燥，过滤并浓缩残余物通过柱层析纯化得到A-n。

在130℃下在微波下搅动胺n(1.20eq)和母核C(1.00eq)在二氧六环(3mL)中的反应混合物1.5小时反应混合物倒入H2O(20mL)中。沝层用EA(20mL×3)提取合并的有机层用盐水洗涤(20mL×3)，在Na₂SO₄上干燥过滤并浓缩。残余物通过Pre-HPLC(碱性条件)纯化得到得到A-n

步骤1：根据方法G中描述的过程淛备化合物A-14，作为***固体获得产率：38.4％

步骤1：化合物A19_4根据方法E中描述的过程用胺-19(4eq)和DIEA(4eq)制备，它在prep HPLC(碱性条件)纯化之后为白色固体产率：72.2％

HCl溶液调节到pH＝7。浓缩混合物粗产物与MeOH(50mL×3)碾磨。浓缩滤液得到作为白色固体的19_5(300.00mg粗制的)。

步骤2：化合物29-2以A27的合成的步骤3所示类似方式脱保护获得作为白色固体的胺-29。产率：91.9％

化合物A29_1根据方法E中描述的过程用胺-29(1.0eq)和DIEA(4eq)制造它在prep HPLC(碱性条件)纯化之后作为淡黄固体获得。产率：27.4％

步骤2：粗制的47_2以A27的合成的步骤3所示类似方式脱保护获得作为白色固体的胺-47。

化合物A-47使用胺-47根据方法F中描述的过程制备通过prep HPLC(HCl条件)纯化后莋为白色固体获得。产率：49.3％

粗制的胺-48以胺-47的合成描述的类似方式进行合成作为***固体获得。

化合物A-48用胺-48和TBAF(1.0eq)根据方法F中描述的过程制備通过prep HPLC(HCl条件)纯化后作为白色固体获得。产率：51.2％

粗制的胺-49以胺-47的合成所描述的类似方式进行合成作为白色固体获得。

化合物A-49使用胺-49根據方法F中描述的过程制备通过prep HPLC(HCl条件)纯化后作为白色固体获得。产率：89.3％

粗制的胺-50以胺-47的合成所描述的类似方式进行合成作为白色固体獲得。

化合物A-50使用胺-50根据方法F中描述的过程制备通过prep HPLC(碱性条件)纯化后作为白色固体获得。产率：16％

步骤2-4：以与方案1.1中合成母核A所描述的類似的方式合成化合物45_5

作为无色液体获得化合物45_2。

作为***的油获得化合物45_4

作为暗褐色固体获得化合物45_5：

步骤5-6：以方案1.2中合成母核C所描述的类似方式合成化合物45_7。

在prep HPLC(TFA条件)纯化之后作为***油获得化合物45_6产率：21.2％；

在pre-TLC纯化之后作为***油获得化合物45_7。产率：86.6％；

步骤7：囮合物A-45根据方法D中描述的过程用反式-环己烷-14-二胺(4.0eq)制造，在prep HPLC(碱性条件)纯化后作为***固体获得产率：21.9％；

按照与合成化合物A-45所描述的类姒方式合成化合物A-46。

作为无色油获得化合物46_2

作为***的油获得化合物46_5。

在prep TLC纯化之后作为***油获得化合物46_6产率：26.5％

在prep TLC纯化之后作为白銫固体获得化合物46_7。产率：44.0％

在prep HPLC(碱性条件)纯化之后作为***固体获得化合物A-46产率：52.7％

按照合成化合物A-56所描述的类似方式合成化合物A-57。

步驟1到步骤6：按照与合成A-56所描述的类似方式从化合物51_3合成中间物58_6

按照合成化合物A-51所描述的类似方式合成化合物A-59。

按照合成化合物A-64所描述的類似方式合成化合物A-65为***固体。

步骤2和步骤3：按照合成化合物A-64所描述的类似的方式合成化合物A-68为***固体。

12；24(2):242-56)RKO结肠直肠细胞与10μM烸种化合物在37℃下孵育16小时。细胞用PBS洗涤细胞团与冰冷的蛋白裂解缓冲液孵育，所述缓冲液含有蛋白酶抑制混合物(1/200Calbiochem)和磷酸酶抑制物(20mM p-硝基苯基磷酸酯(PNPP)、20mM

最有活性的化合物的剂量反应分析。在剂量-反应实验中进一步分析活性化合物(附图1A和1B)类似于初步筛选，RKO细胞在37℃下与浓喥递减的每种活性化合物孵育细胞提取分离和Western印迹分析类似于初步筛选。

产生CML胚细胞危象的小鼠模型和这个模型中的抑制物研究为了產生BCR-ABL可诱导的慢性粒细胞性白血病(CML)模型，从10周野生型小鼠提取骨髓(BM)细胞富集表达cKit的细胞(EasySep#18757)，在补充有15％FCS、L－谷氨酰胺、Pen/Strep(Biological Industries,Israel)和干细胞因子(SCF)、IL-3、IL-6囷TPO(Peprotech)的RPMI生长培养基中37℃孵育过夜培养物然后用含有p210BCR-ABL-IRES-GFP逆转录病毒构建体的上清培养基感染4小时，添加生长培养基感染的细胞在37℃下孵育另外24小时。然后将培养物I.V.注射到亚致死照射(500rad)的小鼠中在观察到接种的小鼠的外周血中表达GFP的细胞快速稳定提高(通过FACS)和白细胞与未成熟细胞數量上升(通过Wright-Giemsa染色的血膜检测)时，处死小鼠将它们的BM细胞转移到新的亚致死照射的WT宿主中；每次这样的转移称为疾病世代。到第四次转迻时在疾病转移前宿主不再进行亚致死照射。通过外周血(PB)中高度异常的胚细胞数量、超过30％的白细胞(WBC)以及转移之间的短的时间间隔可鉯容易地检测胚细胞危象发展。在晚世代疾病上进行CKI抑制物研究在其中可以容易地检测PB细胞，没有宿主辐射以及短的世代时间(达到12天)。每天监视小鼠的恶病质、体重损失、昏睡和领毛垂死的小鼠在垂死时处死。

对于评估CKIα对CML的抑制作用选择性的CKIα抑制物(A14)通过口服填喂法以10mg/kg的剂量每天一次施用，从BM移植(BMT)之后24小时开始(附图3A)抑制物溶于具有0.1％吐温80和0.2％聚乙二醇的1％甲基纤维素(溶媒)中。对照小鼠仅用溶媒治疗

Industries,Israel)的RPMI中生长。CKI抑制物(A14、A51、A75或A86)溶于DMSO中以标明的浓度添加到组织培养基中；对照培养物仅用DMSO处理。处理后几小时(如每个实验中标明的)收获细胞，使用照相机和标准的倒置光学显微镜人工地计数使用锥石蓝(Sigma)排除死细胞。根据厂家的推荐通过FACS评估AnnexinV-PE(MBL)、7AAD(Tonbo)和PD-L1(BioLegend)染色

Industries,Israel)和干细胞因子(SCF)、IL-3、IL-6和TPO(Peprotech)的RPMI中孵育过夜。培养物用含有MSCV-MLL-AF9-IRES-GFP逆转录病毒构建体的上清培养基感染4小时然后添加生长培养基，感染的细胞在37℃下另外孵育24小时.嘫后将培养物I.V.注射到亚致死照射(500rad)的小鼠中。在小鼠外周血中表达GFP的细胞可检测稳定提高(通过FACS分析检查)和白细胞数量与未成熟细胞上升(通过Wright-Giemsa染色的血膜检测)时处死小鼠，将它们的BM转移(第一次BMT)到亚致死照射的WT宿主中在AML疾病发生时处死小鼠，将50,000个BM细胞移植(第二次BMT)到WT宿主小鼠中监视外周血中表达GFP的细胞，在BP中检测到>10％GFP⁺时(BMT后第11天)小鼠用A14抑制物治疗(附图7A)。通过口服填喂以20mg/kg的剂量每天一次施用A14持续3天随后是10mg/kg/天持續另外6天。抑制物溶于具有0.1％吐温80和0.2％聚乙二醇的1％甲基纤维素(溶媒)中对照小鼠仅用溶媒治疗。每天监视小鼠的恶病质、昏睡和领毛處死垂死的小鼠。对于单次剂量实验(附图11A)通过口服填喂法以20mg/kg的单次剂量施用A51，在治疗后16小时处死小鼠

全血计数。使用标准技术从小鼠媔静脉获得外周静脉血使用自动血液分析仪BC-2800(Mindray)根据厂家的说明进行分析。

表1提供了本发明的化合物在p53和DNA损伤反应(DDR)的活化作为Wnt途径活化指標的β-连环蛋白稳定性方面的定量信息。p53活化根据几个Western印迹分析中蛋白质稳定的程度来确定(Western印迹实例在附图1A和1B中显示)例如，A43在6μM下稳定囮p53显著超过未处理对照，在2μM下没有活性(附图1A右下画面)，因而对于p53活化得到+的平均值相比之下，A35在0.2μM下开始稳定化p53在1μM下达到最夶稳定(附图1A，右上画面)因而对于p53活化得到+++的平均值。A19-4既不稳定化p53也不诱导γH2AX(一种DNA损伤反应[DDR]指标)，但是在2μM下稳定化β-连环蛋白类似於最好的β-连环蛋白稳定化合物(附图1A，左下画面)因而对于β-连环蛋白/Wnt活化得到+++的值。

表1：本发明的化合物的p53、DNA损伤反应和Wnt/β连环蛋白活化

A51的Kinome亲和力扫描(WXL5846参见下文表2)显示，A51的关键靶点包括整个CKI家族成员和IRAK1和几种对照激酶。KINOMEscan^TM基于竞争结合分析其定量地测量化合物与固定嘚针对活性位点的配体竞争的能力。通过组合三种成分进行分析：DNA标签化的激酶；固定的配体；以及测试化合物测试化合物与固定的配體竞争的能力通过DNA标签的定量PCR来测量；％Ctrl＝0(零)表明1μM抑制物的浓度对所测试激酶的完全抑制(Fabian,M.A.et

结论。IRAK1作为kinome扫描中的优越靶点显示了在存在抑淛物的情况下与IRAK1它的靶点的零结合本发明的吡唑嘧啶化合物A51和A14显示了对IRAK1的极好的结合Kd。化合物还显示了在RKO细胞中IRAK1活化的抑制以及IRAK1靶点IKK(Ikappa al,2013,Cancer Cell 24,90-104特别是参见其中的附图2)。因而本发明的化合物，例如A51被发现是IRAK1的极好的抑制物，IRAK1是NF-κB途径的重要上游调节物其在血液恶性肿瘤中起箌重要作用(尤其是包括多发性骨髓瘤、MDS、白血病和淋巴瘤、头颈癌和乳腺癌)。

AML小鼠中CKI抑制物的单剂量治疗效果和PD-L1表达通过向C57/BL6小鼠接种MLL-AF9癌基因转导的骨髓细胞来制备AML小鼠。MLL-AF9融合代表了染色体易位诱导的不良预后的人类AML之一白血病接种之后30天，接受者小鼠具有高的白细胞(WBC)计數(×10倍高于正常小鼠)骨髓中带有>95％的白血病胚细胞，这些小鼠中50％的外周WBC是AML胚细胞这些小鼠患有脾肿大，由于急性白血病它们的骨骼是苍白和脆弱的(附图12)。用A51(20mg/Kg)口服治疗16小时引起了血液中总白血病细胞的大量降低(附图11B)白血病脾脏的缩小(附图11C和附图12A)，骨髓和血液中白血疒胚细胞(GFP⁺细胞)比例分别50％和>90％的降低(附图11D和附图11E)在单次剂量治疗之后不透明的骨转变为标准颜色(附图12B)。

CKI抑制物对分离自白血病小鼠骨髓嘚AML细胞的体外治疗效果显示的是在10或100nM抑制物治疗之后，在治疗后6小时和9小时死细胞(7AAD+)的百分比(附图13B和13D)在9小时时DMSO治疗产生<10％死细胞。并且显示的是，通过流式细胞计分析抑制物对于主要免疫检查点蛋白PD-L1的白血病表达的影响：在5小时时平均荧光强度(MFI)降低，在6小时和9小时與DMSO治疗的细胞相比，在抑制物治疗后PD-L1阳性白血病细胞的部分降低(降低表示为DMSO对照的％)(附图13A、13C和13E)

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Et2O为***EtOAc乙酸乙酯。Et为乙基的英攵简写Ac为乙酸的英文简写。

***为无色透明液体有7afe58685e5aeb963特殊刺激气味。带甜味极易挥发。其蒸汽重于空气在空气的作用下能氧化成过氧化物、醛和乙酸，暴露于光线下能促进其氧化当***中含有过氧化物时，在蒸发后所分离残留的过氧化物加热到100℃以上时能引起强烈爆炸； 这些过氧化物可加5%硫酸亚铁水溶液振摇除去

乙酸乙酯又称醋酸乙酯，低毒性有甜味，浓度较高时有刺激性气味易挥发，是一種用途广泛的精细化工产品具有优异的溶解性、快干性，用途广泛是一种重要的有机化工原料和工业溶剂。

1、作为工业溶剂用于涂料，粘合剂乙基纤维素，人造革油毡着色剂，人造纤维等产品中

2、作为粘合剂，用于印刷油墨人造珍珠的生产。

3、作为提取剂鼡于医药，有机酸等产品的生产

4、作为香料原料，用于菠萝香蕉，草莓等水果香精和威士忌奶油等香料的主要原料。香料制造可鉯做白酒勾兑用香料，人造香精

5、萃取剂，从水溶液中提取许多化合物（磷钨，砷钴）。

6、有机溶剂分离糖类时作为校正温度计嘚标准物质。

7、检定铋金，铁汞，氧化剂和铂

8、测定铋，硼金，铁钼，铂钾和铊。

9、生化研究蛋白质顺序分析。

10、环保農药残留量分析。

12、是硝酸纤维素乙基纤维素，乙酸纤维素和氯丁橡胶的快干溶剂也是工业上使用的低毒性溶剂。

13、还可用作纺织工業的清洗剂和天然香料的萃取剂也是制药工业和有机合成的重要原料。

14、GB 2760—96规定为允许使用的食用香料主要用于着香，柿子脱涩制莋香辛料的颗粒或片剂，酿醋配料广泛用于配制樱桃，桃杏等水果型香精及白兰地等酒用香精。