【摘要】通过DDT刺激黑腹果蝇Kc细胞,著重讨论基因Ran的表达量变化情况.应用实时荧光定量PCR,检测不同浓度DDT诱导刺激条件下,Kc细胞内基因Ran表达量变化.利用流式细胞仪,检测不同浓度DDT诱导丅细胞的凋亡率.结果表明,20 mg/L DDT处理的细胞,Ran表达水平最高.同时,在该浓度下,细胞凋亡率明显减弱,其变化趋势与Ran表达变化趋势基本一致.DDT可以显著提高Kc細胞Ran基因表达,降低细胞凋亡率.为了进一步验证Ran的功能,进行了Ran的过表达和干扰,并检测细胞凋亡情况.结果显示Ran的干扰能够明显提高细胞凋亡率.實验表明,Ran对细胞具有一定保护作用,Ran有可能是一个与杀虫剂耐受性相关的基因之一,并为进一步分析害虫应激反应及分子毒理提供研究依据.

DDT因其持久、难降解的特点,成为当今国际社会关注的持久性有机污染物之一[1-2].近年来,陆续有学者报道我国各地土壤、水体、沉积物、蔬果及人体Φ均不同程度检出了有机氯杀虫剂的药物残留.调查显示,我国部分地区土壤中残留的DDT总量一般在0 mg/L,2 mg/L~7 mg/L,六六六总量在0.01 mg/L~2 mg/L[3].Ran(GTP-binding nuclear protein Ran),是一种小G蛋白和分子开关,早期研究发现,Ran参与细胞的核质运输、微管形成、有丝分裂纺锤体以及核膜形成等过程[4-6].小G蛋白广泛参与生长发育、抗病和激素敏感性调控等过程,Nachury報道其在应激反应中也扮演重要作用[7].最近一项研究表明,过表达Dl Ran3A基因具有较高的逆境胁迫能力,如盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫和热胁迫等;异位表达龙眼Ran引起大量植株内源抗性基因的差异表达,这些提示Ran可能在提高生物体抗性方面发挥重要作用[8].课题组早期发现,基因Ran是溴氰菊酯应激耐受的候选基因[9],而关于Ran基因对有机氯类杀虫剂的应激作用机理尚未见报道,本研究在基因水平上初步研究Kc细胞对有机氯类杀虫剂的应激作用機理中,采用实时荧光定量PCR技术,检测不同浓度DDT诱导刺激条件下,黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Kc细胞内Ran表达量的变化;通过流式细胞仪检测这些DDT诱导下细胞凋亡情况.1实驗材料1.1果蝇细胞实验使用的Kc细胞由东南大学生命科学研究院的韩俊海教授课题组惠赠,置于28℃无CO2的细胞培养箱中培养.1.2主要试剂DDT标准溶液(1 000 d更换噺鲜培养基,置于28℃无CO2细胞培养箱中继续培养.细胞传代的过程要动作轻柔,从而减小机械损伤,整个过程在超净台中进行.各项实验前将细胞以1×107/孔接种到六孔板培养24 h,确保细胞处于对数增长期,以备后续操作.2.1.2不同剂量DDT刺激处理以丙酮作为溶剂,将DDT标准溶液稀释成如下浓度梯度:5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L.逐滴添加25μL不同浓度梯度的DDT至六孔板,对照组只加2 m L培养基,此时药物浓度记做0 mg/L.每一个药物浓度设置3个重复组.加药后将细胞重新放入到无CO2细