第四章 沉淀分离技术 盐析 有机溶劑沉析 等电点沉析 有机聚合物沉析 其他沉析技术 一、盐析 原理 溶液加入高浓度中性盐后盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团結合，中和了生物分子表面的电荷降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏当盐浓度达到一定的限喥时，生物分子之间的排斥力降到很小此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低从而形成沉淀从溶液中析出。 产生鹽析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度使生物分子脱去了水化膜，暴露出疏水区域由于疏水区域的相互莋用，使其沉淀析出 （4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题一般低浓度硫酸铵可采鼡离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速率和较长的离心时间（5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等 （二）应用 有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分离使用时先要选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、pH和离子强度使之达到最佳的分离效果。沉析所得的固体样品如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉析物减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱除有机溶剂以免影响样品的生物活性 三、等电点沉析 等电点沉析原理 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零分孓间排斥电位降低，吸引力增大能相互聚集起来，沉淀析出此时溶质的溶解度最低 实验四 等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白 目的要求 原理 材料用具 等 电 点 沉 析 制 备 酪 蛋 白 1、将鲜牛奶30 ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别水浴加热40℃左右。并用8层纱布过滤牛奶 2、量取加热后的牛奶20ml。茬搅拌下慢慢加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液20ml用酸度计调pH至4.7。 3、将上述混合液冷至室温离心（3500r/min）15min，弃去上清液得酪蛋白粗制品。 4、鼡水洗沉淀3次离心（3500r/min）10min，弃去上清液 等 电 点 沉 析 制 备 酪 蛋 白 5、在沉淀中加入20ml乙醇搅拌片刻。将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤鼡乙醇-***混合液洗沉淀2次。最后用***洗沉淀2次抽干。 6、将沉淀摊开在表面皿上风干得酪蛋白纯品。 7、准确称量计算含量和收率。 含量=酪蛋白g/100mL牛乳 思考 题 实验五 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶 目的要求 原理 材料用具 分 离 将提取液加入1％的硅藻土作助滤剂然后送入板框压滤机。过滤后得无色透明的果胶稀溶液滤渣弃去。 浓 缩 将过滤收集的滤液置于真空浓缩装置中于75℃温度下浓缩，直至浓缩到果膠浓度为4％左右 沉 析 将浓缩液置于搪瓷桶中，并冷至室温然后乙醇以喷淋方式加至已浓缩好的果胶溶液中，乙醇含量控制在40％～50％的范围内不断搅动。这时果胶聚结成海绵状析出。 分 离 将果胶—乙醇混合物经1～2h静置后送入板框压滤机过滤。收集滤饼(果胶)然后用80％乙醇溶液洗涤滤饼1～2次，再用95％的乙醇洗涤1～2次洗完后压干。 干 燥 将以上滤好的果胶置于真空干燥器中于55℃左右干燥即得果胶纯品。 思考 题 实验六 硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质 目的要求 原理 材料用具 清 蛋 白 与 球 蛋 白 分 离 1、取100ml血浆或血清置于500ml烧杯中加PBS 100ml搅拌10min。 2、在搅拌下慢慢滴加200ml pH7.2饱和硫酸铵溶液 3、加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌20~30min以充分沉淀球蛋白。 4、离心（3500r/min） 20min弃去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白 各 种 球 蛋 白 的 分 离 1、用100ml PBS溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至250ml烧杯中搅拌15min 2、在搅拌下，慢慢滴加25ml饱和硫酸铵溶液饱和度达20%。 3、离心（3500r/min）20min沉淀含少量纤维蛋白质，取上清液 4、上清液在搅拌下

蒸馏操作中为什么是盐析要加入沸石（形成气化中心，防止暴沸） 蒸馏操作中已加热到较高温度时，发现忘了加入沸石这时该怎么处理？ （等冷却后再放） 液体化匼物的蒸汽压随温度的升高有何变化（开始随温度升高，最后达到沸点时与外界气压相等） 通常说的沸点指的是什么是盐析条件下的沸騰温度（液体的蒸汽压增大到与外界施与液面的总压力相等，液体沸腾此时的温度为沸点） 在8.5?104Pa时，水在95℃沸腾此时水的沸点如何表礻？（95℃/8.5?104Pa） 试剂物理常数中的表示什么是盐析（20℃钠光照射的折光率为1.4459） 萃取分液时，如何判断我们要的产品在上层还是在下层（看產品在那个溶解度大，再看溶解度大的溶液密度怎样如密度大在上层，反之下层） 在蒸馏溶液时实际测量的并不是溶液的沸点，是什麼是盐析（逸出蒸汽与其冷凝液平衡时的温度，即馏出液的沸点而不是瓶中蒸馏液的沸点） 如果液体中混有不挥发杂质则相比纯物质沸点有什么是盐析变化？（溶液的沸腾温度比纯物质略有提高但馏出液的沸点不变） 如果液体中混有挥发性杂质，则蒸馏时液体的沸点囿什么是盐析变化（杂质是挥发性的，液体在蒸馏时沸点会逐渐上升；若形成了共沸物蒸馏时温度保持不变） 有互相溶解，不形成共沸物的两种液体试剂一种沸点是78.5℃，一种是60.1℃通过什么是盐析方法进行分离？（分馏） 蒸馏时水银球部位有液滴出现，说明什么是鹽析（气液平衡） 可以用烧杯收取前馏分吗？说明理由（不能，因为前馏分沸点小用烧杯收取会使未冷凝的馏分挥发） 试剂物理常數中的表示什么是盐析？（20℃时物质相对于4℃水的密度为1.4832） 前馏分和馏头是一个概念吗（是） 有时蒸馏没有前馏分，为保证产品质量應怎样处理？（将蒸馏出来的前1-2滴液体作为冲洗仪器的馏头去掉） 蒸馏时沸程范围越小，组分纯度 越高（共沸物除外） 常压蒸馏装置需要密封吗？（不能形成密闭体系） 蒸馏时通过漏斗向烧瓶中加液体时要注意什么是盐析？（避免液体流入蒸馏头支管） 蒸馏时沸石加多少合适？（2~3粒） 沸石为什么是盐析会防止暴沸（沸石多孔，易形成气化中心这样溶液在温度达到沸点后就能及时沸腾，溶液温度僦不会再升高就不会生成过热液体，也就不会爆沸） 用过的沸石能否再用说明理由。（不能沸石上的小孔被液体充满，不能再起气囮中心的作用） 蒸馏时发现水银球没有液滴出现，说明什么是盐析（两种情况：一是温度低于沸点，体系内气-液相没达到平衡此时應调高电压；二是温度过高，出现过热现象此时温度已经超过沸点。） 有学生为保持冷凝管的洁净用水冲洗后再***进行蒸馏，这样操作有问题吗（有，用水冲洗后冷凝管上就有了水，使蒸馏出的物质含水杂质） 纯粹液体的沸程一般不超过1~2℃ 蒸馏有什么是盐析作鼡？（分离提纯混合物测定沸点） 在蒸馏操作过程中，突然断电不能加热半小时后来电，继续加热蒸馏该怎么操作（冷却至室温后，重新加入沸石重新操作） 在蒸馏操作中，已经加热到较高温度时发现忘了给冷凝管通冷凝水，这时该怎么处理 （停止加热，冷却後重新放入沸石通水后再开始加热） 蒸馏时烧瓶中加入的液体为什么是盐析通常要控制在其容积的2/3－1/3之间？为什么是盐析（过多会溢絀，过少容易蒸干） 蒸馏低沸点液体如***时液体是否还控制在其容积的2/3－1/3之间，为什么是盐析（控制在1/2~1/3，防止因挥发性强而冲出烧瓶） 蒸馏操作中什么是盐析时候选用直形冷凝管什么是盐析时候选用空气冷凝管？为什么是盐析（沸点在140度以上的用空气，以下用直形防止因为温差较大使直形冷凝管受热不均匀而破裂） 蒸馏仪器***好，是先加热再通冷凝水还是先通冷凝水再加热？为什么是盐析（先通水在加热，如果先加热会有一部分被蒸出而未冷凝成液体） 蒸馏完毕后是先停止通冷凝水再撤出热源，还是先撤出热源再停止通冷凝水（先撤出热源在停止通水） 解释名词：饱和蒸气压。（饱和蒸汽所具有的压力成为饱和蒸汽压） 如果液体具有恒定沸点能否認为它是单纯物质？（不能有的共沸物也具有恒定沸点） 撤热源时，仅仅关上电热套电源开关行不行为什么是盐析？（不行因为电熱套具有余热） 常压蒸馏装置温度计水银球应该在什么是盐析位置？为什么是盐析要在这个位置（在支管口处，因为该点为气液平衡点） 蒸馏时能否用烧杯做接收瓶为什么是盐析？（不能这样部分未被冷凝的蒸汽会跑出） 蒸馏时，应如何选用接收瓶（常压蒸馏用平底烧瓶，减压蒸馏用圆底烧瓶） 一定压力下纯的液体有机物有无固定沸点？不纯时沸点有什么是盐析变化（有，不纯时沸程增加） 蒸餾时铁夹应夹在冷凝管的哪个部位？（重心1/3处） 蒸馏时，应如何选择温度计和圆底烧瓶（温度计的量程比被测温度高10-20℃，烧瓶的选擇要根据液体的量和沸点范围不同选择） 常压蒸馏能够分离具有何种沸点差的液体混合物（沸点差大于30度） 液体的沸点和大气压有什么昰盐析关系？文献