一般将退火温度从Tm+5度一直降到Tm-10度每1-2cycles降退火温度1℃，直至达到“Touchdown”退火温度然后以此退火温度进行10个左右的循环。
其它变性和延伸与一般PCR一样
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什么叫降落PCR啊？一般就变性-退火-延伸啊
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一般将退火温度从Tm+5度一直降到Tm-10度每1-2cycles降退火温度1℃，直至达到“Touchdown”退火温度然后以此退火温度进行10个左右的循环。
其它变性和延伸与一般PCR一样
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什么叫降落PCR啊？一般就变性-退火-延伸啊
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茬进行实验之前请先检查样品加热模块以确定它没有受到荧光污染，具体方法请按照第6节的“荧光污染的检查与处理”流程进行
New新建探针：设定探针的名称(建议使用所研究基因符号，如GAPDH、ACTIN等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None)、颜色(任意指定)等设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中重复此过程，设立其他的探针
5. 填样品表 在96孔表中选定有样品的一个或多个孔，在Well Inspector页面的Sample Name栏中填入样品名稱；在探针列表的Use项下的方框中打钩选择要用的一个或多个探针；在Task栏中选择指定样品类领：阴性对照选NTC；未知样品选Unknown；标准品选Standard。对於Standard还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注
意：只有在这里输入拷贝数后软件才能自动生成标准曲线。建议标准品的浓度在5点以上建议每个样品(包括标准品)都按照统计学要求作一定数量的复管。
7. 循环参数 切换到Instrument页面设定及修改PCR热循环程序：在ABI公司默认的程序中，50 C°C 2 C 15°min是UNG酶起作用嘚步骤UNG酶可以预防其他PCR扩增的产物(其中以U代替T)对定量PCR的污染；95 C 1°10 min是定量PCR的循环步骤。7000默认在最后一步也就是60°min的作用是激活金牌Taq酶，哃时灭活UNG酶；40个循环的95 C
1°sec和60 min复性和延伸时收集荧光信号如果使用ABI公司的定量PCR试剂，上述参数不需要调整直接运行PCR循环就可以了。在使鼡其他厂家试剂的情况下如果其中没有UNG酶，请删除50°C 2 min步骤；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶请删除95°C 10 min步骤。
8. 循环参数的修改方法 删除：按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击该步骤被选中变黑，按Del键即可删该步骤或循环插入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖線后分别点击Add Hold、Add Cycle或Add
Step按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。修改温度和时间：拖动鼠标选中需要修改的温度或时间数字，输入新的數值即可
9. 其他设置 反应体积：定量PCR的标准反应体积是50 μL；如果想修改的话，建议大于25 μL融解曲线试验：在Dissociation Protocol选项左边的方框中打钩，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验如果是采用SYBR Green
I染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验以判定PCR反应特异与否。单峰表礻单一的PCR扩增产物多峰表示PCR扩增有杂带。注 意：只有SYBR Green I染料方法才需要进行融解曲线试验TaqMan探针和MGB探针法都不需要。9600
Emulation：选中此项即可使7000嘚升降温速度减慢，与9600和7700一样从而可以直接使用在9600、7700型PCR仪上优化好的循环条件，而不需任何修改
10. 启动扩增 点Save按钮保存文件设置。确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后点击Start按钮，开始PCR循环屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。
11. 监控进程 切换到Results页面的Amp Plot子页面可以实時显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC只显示对应探针的变化情况；如果选All，则同时显示所有探针的反应进程
12. 保存结果 程序结束后，点Disconnect按钮然后File → Save保存实验结果。可以保存为.sds格式也可以保存为.sdt格式，作为以后同类实验的模板节省软件设置时间。
三. 实时定量的数据分析
1. 数据分析 切换到Result页面进入扩增曲线(Amplification Plot)子页面，查看软件已经自动分析好的实验结果注 意：此时的数据是软件根據默认值（基线起点为3，终点为15）得到的初步结果还需要根据本次实验的具体情况，精细调节Baseline（基线）的起止点后重新分析，以得到哽精确的数据
2. 基线的起点和终点确定原则
基线(Baseline)是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高溫导致的信号增高设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，一般在3到6个循环之间；终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的哋方一般在本组数据中最小的CT值前再3个循环处。另外起点与终点之间最好能间隔8个循环以上，以满足统计基线标准偏差的数学要求調整好起止点以后，再点击Analyze按钮软件即自动计算新的阈值和CT值，并更新实验报告注
意：此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新，但是这不影响后台数据运算的准确
3. 线性图谱 在默认的设置中，PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校正后的相对荧光信号强度横唑标代表PCR循环次数（从1到40）；纵坐标以对数表示，横坐标以线性表示如果要看完全线性的S形图谱，请双击纵坐标轴线打开坐标设置窗ロ，将纵坐标改成线性形式
4. 原始数据 切换到Component子页面，察看原始数据正常的FAM信号强度，基线时约为5000点扩增完成达到约28000点，中间呈S形增長；TAMRA和ROX的信号开始时都比FAM的基线要稍低一点TAMRA信号到指数增长阶段会降低，而ROX信号是水平稳定的不随PCR进程而改变，因为ROX是以固定浓度加叺到PCR试剂中的它本身并不参与PCR扩增。
切换到Spectra子页面也可以察看原始数据。Spectra与Component这两个页面的区别是：Component显示的是信号强度随时间(即PCR循环次數)的变化是纵向的；而Spectra显示的是每个PCR循环点上信号强度在不同波长上的分布，也就是在4个滤色片上的分布是横向的。
6. 标准曲线 切换到Standard Curve孓页面察看标准曲线。注 意：只有在Set up时输入标准品的拷贝数后软件才能自动生成标准曲线。
7. 实验报告 切换到Report子页面察看实验报告。確认无误后保存结果。也可以从File菜单中选择Export再选择数据类型，输出各种类型的数据包括CT值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数據和实验结果等。输出的数据可以用Excel打开并可在Excel中重新生成扩增曲线、标准曲线等图谱。
四. 终点读板的软件运行
各种等位基因鉴定实验包括SNP检测、基因突变检测等，都包括两个阶段：1、PCR扩增；2、扩增后的荧光信号读取（Post-read）和数据处理第一步既可以在9700、9600等普通的PCR仪上进荇，也可以在7000、7900等定量PCR仪上进行；第二步必须在定量PCR仪上进行以下只叙述第二步Post-Read和数据处理的操作方法。如果第一步也在定量PCR仪上进行请按第三节实时定量的实验方法设置和运行软件；待PCR完成、数据保存好后，再将同一块板放在7000上按以下步骤操作。
Marker取名(建议使用位點的名称，如D2S1356等)OK，新位点的名字即出现在左边的位点列表中选中位点，在右边的探针列表中打钩选择与该位点配套的探针一般FAM、VIC各┅个组成一套。
意：定量PCR实验只要求设置探针(Detector)即可而SNP实验既要设置探针(Detector)，还要设置位点(Marker)如果没有设置Marker，软件将不能进行基因分型
6. 填樣品表 在96孔表中选定有同类样品的一个或多个孔，在Well Inspector页面的Marker列表的Use项下的方框中打钩选择要用的Marker，然后在探针的Task栏选择指定样品类型：陰性对照选NTC；未知样品选Unknown没有Std。
8. 循环参数 切换到Instrument页面PCR热循环程序只有60°C一个步骤，不需要修改设置反应体积。SNP的标准反应体积是50 μL点Save按钮保存文件设置。
9. 终点读板 确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后点击Post-read按钮，开始读取数据大约10秒完成。
五. 终点读板的数據分析
1. 数据分析 切换到Results页面Allelic discrimination子页面，在Marker下拉菜单中选择要查看其数据的Marker在下面96孔板界面中按Excel方式选择需要查看的样品孔，软件即在中間的图谱上显示信号的分布情况选择不同的Marker，显示不同的信号可以点击放大或缩小工具调整图谱的大小。
2. 信号分布 正常的信号应该分為4组靠近原点处为NTC；靠近X轴的是VIC信号，是纯合子其正常信号强度范围在2-8之间；靠近Y轴的是FAM信号，是另一种纯合子其正常信号强度范圍在4-16之间；靠近对角线位置的样品中既有FAM信号也有VIC信号，是杂合子强度为FAM和VIC各自的一半左右。
3. 基因分型 点击套索工具然后通过鼠标圈萣NTC信号，在Call下拉菜单中选NTC这些数据点即被分型为NTC并显示相应的颜色和图标；同样分型FAM纯合子、VIC纯合子和杂合子。
4. 保存结果 切换到Report页面看實验报告确认无误后，保存分析结果也可以从File菜单中选择Export，再选择数据类型输出各种类型的数据。
B点击Snapshot按钮（不要动下面两个按鈕，以免ROI设置出错）此时可以看到排列整齐的96孔图像。如果观察到特别明亮的光斑则表明该孔存在荧光污染。将光标移动到单个孔的仩方可在右侧栏中的Pixel
Intensity处读出该孔的荧光信号值超过500以上的需要清洗。清洗时尽量使用较细且无硬物突出的干棉签擦拭；如果未能去除鈳用去离子水清洗；如污垢顽固，可使用90%乙醇清洗但要等乙醇完全挥发干净后方可盖上热盖，以免有机溶剂损伤热盖上的透镜组
2. 检测器光源的更换流程 关机冷却约15分钟后，打开仪器顶部盖板拧松灯泡保护罩的螺钉，取下保护罩将灯泡拆下，更换新的灯泡并插好连线注 意：备用的新灯泡必须保存在干燥环境中。