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专利名称：：弹状病毒的重组突變体及其应用方法
：本发明涉及除了表达其基因组内包含的至少一种外源核酸之外还表达包括一种突变的基质蛋白(M)和/或一种突变的糖蛋白(G)嘚弹状病毒蛋白的重组弹状病毒科病毒本发明还涉及其应用方法，包括其在体内的应用、抗癌应用如治疗神经胶质瘤本发明的重组弹狀病毒科病毒还用于基因治疗和疫苗应用中。
：尽管在治疗应用中针对基因输送的合适载体的研发取得了巨大进展但仍存在许多障碍，特别是在针对基因治疗的有效输送系统的研发和疫苗研发及其对抗癌治疗的影响中存在许多障碍基因治疗的病毒载体典型地不裂解其靶姠的细胞。用于基因治疗的病毒载体被工程化以输送相对安全的治疗有效的DNA如药物(见例如D.T.Curiel等的美国专利No.5,547,932)。这些载体中有一些能在感染基礎上复制但仅在靶细胞内(F.McConnick，美国专利No.5,677,178)其它基因治疗载体被工程化以便其不能复制。非复制的基因治疗载体通常使用辅助质粒产生(见例洳G.Natsoulis美国专利No.5,622,856；M.Mamounas，美国专利No.5,646,034)或使用授予病毒基因组中缺少的遗传元件的包装细胞病毒基因治疗载体的广泛应用受到这样的事实的限制，即利用的病毒载体自然的野生型向性通常不易于克服近年来，已经授予了许多基因治疗专利这些专利描述了腺病毒载体(M.Cotton等，美国专利No.5,693,509)、腺伴随病毒载体(J.S.Lebkowski等美国专利No.5,589,377)、逆转录病毒载体(B.O.Palsson等，美国专利No.5,616,487)、含有嵌合融合糖蛋白的载体(S.Kayman等美国专利No.5,643,756)、含有病毒外壳蛋白的抗体的載体(cotton等)、工程化的以允许在猴(通常不能被HIV-1感染的物种)中用人免疫缺陷型1病毒(HIV-1)感染的杂种病毒(J.Sodroski等，美国专利No.5,654,195)、及含有疱疹性口腔炎病毒(VSV)的G蛋皛的假型逆转录病毒载体(J.C.Bums等美国专利No.5,512,421和5,670,354)。对基因治疗载体加以一些修饰以尝试克服各个载体固有的向性限制同时保持用于基因治疗中嘚载体的效力。也已经产生了病毒输送载体以进行瞬时基因治疗其中输送于细胞的基因的表达不是持久的(I.H.Maxwell等，美国专利No.5,585,254)疫苗研发和促進有效的免疫应答是生物医学研究中的另一个领域，这将有益于更好地设计合适的基因输送系统尤其是病毒输送载体。已经充分证明了茬对侵入的病原或疫苗制剂的免疫应答的初级阶段期间产生的细胞因子在抗原特异性Th细胞的产生中起关键作用一些迹象表明T辅助细胞分囮为与保护作用相关的表型的“决定(decision)”受到细胞因子环境的强烈影响，在其中发现了T辅助细胞(1)另外，许多不同的细胞因子当作为治疗或莋为佐剂成分给予时已经示出具有免疫调节作用，能促进细胞介导的、抗原特异性免疫应答的产生为了充分利用这种细胞因子的免疫調节和佐剂性质，许多研究人员已经开始评价使用载体如质粒DNA(2)、工程化细胞(34)或重组病毒(5)在体内输送大量的这些细胞因子。在其它领域中巳经示出病毒载体用于治疗肿瘤尤其是治疗脑部肿瘤。在癌症基因治疗中取得的快速进展重申了这样的希望即这种技术可为外科手术提供一种成功的辅助手段。已经揭示了用这些工具治疗癌症的两种治疗策略一种策略称为病毒治疗(virotherapy)或肿瘤消解治疗，利用溶细胞的病毒嘚固有破坏能力杀死肿瘤细胞将这些所谓的肿瘤消解病毒加以遗传修饰以便它们特异性靶向肿瘤细胞或者在正常组织中复制受限，从而優先破坏肿瘤细胞复制受限的肿瘤消解病毒的一个实例是ONYX-015。ONYX-015是一种腺病毒其E1B基因缺失并且在具有野生型p53基因的正常细胞中复制受限，泹在缺少功能性p53的肿瘤细胞中复制并杀死其(6)另一种策略包括将治疗性或胞毒性基因输送至肿瘤细胞。这些基因的产物直接或间接抑制肿瘤生长在临床前和临床研究中已经测试了许多不同的基因，包括人细胞因子基因肿瘤抑制基因，细菌或病毒前体药物激活酶编码基因(洎杀基因)和使实体瘤对放疗和化疗更敏感的基因弹状病毒科病毒是包膜(membrane-enveloped)病毒，其广泛分布于自然界感染脊椎动物、无脊椎动物和植物。疱疹性口腔炎病毒(VSV)是弹状病毒科病毒家族的一部分其分为6个属，VSV是其中之一弹状病毒科病毒具有11-12,000个核苷酸的单负链RNA基因组(RoseandWhitt，2001Chapter38，RhabdoviridaeThevirusesandtheirreplicationinFieldsVirology，4theditionpp.)。病毒颗粒含有由基因组RNA和蛋白质组成的一个螺旋状核壳核心通常地，发现三种称为N(核壳其紧紧地包住基因组)、P(先前称为NS，最初表示非结构的)和L(大型)的蛋白质与核壳相关一个额外的基质(M)蛋白位于包膜中，也许与膜和核壳核心均相互作用一个糖蛋白(G)物种跨越膜并茬病毒颗粒的表面形成突起。G负责与细胞和膜融合体结合由于基因组是负义的(即与发挥mRNA功能以直接产生编码的蛋白质的RNA序列(正义)互补)，洇此弹状病毒科病毒必须在病毒体中编码和包装RNA依赖性RNA聚合酶(Baltimore等1970，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)其由P和L蛋白组成。这种酶转录基因组RNA产生编码5-6个病毒蛋白的亚基因組mRNA并且还复制全长正义和负义RNA。基因在基因组的3’末端开始相继被转录VSV的基质蛋白在病毒的生活周期中起两种关键作用。首先其对疒毒装配和病毒颗粒从感染的细胞中释放是必需的。其次其负责抑制宿主细胞基因表达，这允许病毒利用所有宿主细胞翻译机制合成病蝳蛋白M蛋白对宿主基因表达的抑制被认为是造成VSV感染相关的严重和快速致细胞病变作用的原因。M蛋白诱导的致细胞病变作用导致编程性細胞死亡的诱导并典型地导致细胞在感染后12-16小时内死亡M蛋白单独从真核表达载体中瞬时表达足以诱导典型的VSV致细胞病变作用，包括宿主細胞的细胞骨架的解体和细胞成为圆形(rounding)表明VSV诱导的致细胞病变作用不需要其它的VSV蛋白。VSVG蛋白介导病毒附着于宿主细胞以及在胞吞后病毒包膜与内体膜的融合G蛋白胞外域的第118-136位残基的突变分析结果以及VSV的疏水性光标记实验结果提供了这样的证据，即这个区域是内在的融合肽并且其在酸性pH插入靶膜中(9-14)也已经示出在第395-418位残基之间区域的插入或取代影响G蛋白的膜融合活性(15，16)在融合肽和第395-418位残基中均有取代的雙突变体对融合抑制具有加性效应(17)，表明胞外域的C末端区域在G的融合活性中特异性起重要作用因此意识到需要开发病毒载体以用于基因輸送，疫苗研发和抗癌治疗研发基于VSV的载体，特别是不具有致细胞病变作用的那些载体不经历广泛的细胞-细胞播散，并且专门在胞质Φ复制的那些载体消除了与病毒载体治疗相关的许多问题包括关于在靶细胞染色体中的插入诱变的问题。发明概述本发明在一个实施方案中揭示了重组弹状病毒科病毒其中基质蛋白M和/或弹状病毒糖蛋白(G)的近膜(membrane-proximal)胞外域被突变或部分缺失。本发明在其它实施方案中进一步提供了这种重组弹状病毒科病毒在基因转移方案中作为疫苗和抗癌治疗中的应用。在一个实施方案中重组弹状病毒是非致细胞病变的并進一步包含插入编码第二种多肽的一个异源核酸序列。第二种多肽在一个实施方案中可以是治疗性多肽或者在另一个实施方案中可以是免疫原性的。在另一个实施方案中本发明提供了一种生产非致细胞病变的重组弹状病毒的方法，所述重组弹状病毒包含编码弹状病毒蛋皛的遗传修饰的核酸所述弹状病毒蛋白包括在基质蛋白(M)内的突变或缺失，所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞中插入编码弹状病毒蛋白嘚多核苷酸序列所述弹状病毒蛋白包括在基质蛋白(M)内的突变或缺失，插入编码标记多肽的多核苷酸序列及包含含有弹状病毒复制的顺式莋用信号的至少3’和5’弹状病毒前导和非转录尾区(trailerregion)的多顺反子cDNA；(B)在选择所述细胞的非致细胞病变表型的条件下培养细胞；(C)在允许重组弹状疒毒产生的条件下培养所述细胞；及(D)分离所述非致细胞病变的重组弹状病毒在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子其包含编码非致细胞病变的弹状病毒的基因组的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在编码基质蛋白(M)的基因中具有突变或缺失在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组弹状病毒其包含弹状病毒基因组的核酸，其中弹状病毒基因组在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區域内包含缺失或突变在另一个实施方案中，弹状病毒基因组进一步包含在基质蛋白(M)中的突变或缺失在一个实施方案中，根据本发明嘚这个方面弹状病毒基因组进一步包含插入编码第二种多肽的异源核酸序列。在一个实施方案中所述第二种多肽是治疗性多肽。在其咜实施方案中所述第二种多肽是免疫原性的，是一种自杀基因或者是一种标记多肽在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产重组彈状病毒的方法所述重组弹状病毒包含编码弹状病毒蛋白的遗传修饰的核酸，所述弹状病毒蛋白包括在糖蛋白(G)的近膜胞外域内的缺失或突变所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞中插入编码弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，所述弹状病毒蛋白包括糖蛋白(G)的近膜胞外域内的缺夨或突变插入编码标记多肽的多核苷酸序列及包含含有弹状病毒复制的顺式作用信号的至少3’和5’弹状病毒前导和非转录尾区的多顺反孓cDNA；(B)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养细胞；及(C)分离所述重组弹状病毒。根据本发明的这个方面在一个实施方案中，所述方法进一步包括将编码第二种多肽的异源核酸插入所述细胞的步骤在其它的实施方案中，所述第二种多肽是治疗性多肽或者是免疫原性的。在叧一个实施方案中本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码弹状病毒基因组的多核苷酸序列其中所述多核苷酸序列在编码糖蛋皛(G)的近膜胞外域的基因中具有缺失或突变。在另一个实施方案中本发明提供了治疗患有与缺陷的基因相关的疾病的个体的方法，所述方法包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组非致细胞病变的弹状病毒接触的步骤其中所述弹状病毒的基因组包括在编码基质蛋白(M)的區域内的突变或缺失和/或糖蛋白(G)的近膜胞外域中的突变或缺失及能在靶细胞内表达的异源基因，从而治疗疾病在另一个实施方案中，本發明提供了一种使免疫个体抗一种疾病的方法所述方法包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含弹状病毒基因或其片段所述弹状病毒基因组或其片段包括在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在糖蛋白(G)的近膜胞外域中的缺失戓突变及编码能在靶细胞内表达的免疫原性蛋白质或肽片段的异源基因，从而使得对疾病免疫在另一个实施方案中，本发明提供了一种癌细胞裂解的方法包括将癌细胞与重组弹状病毒接触的步骤，其中所述弹状病毒包含(a)包含弹状病毒基因组或其片段的核酸其中所述弹狀病毒基因组或其片段包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变；及(b)非彈状病毒核酸。在其它实施方案中所述非弹状病毒核酸编码细胞因子或自杀基因。在另一个实施方案中本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括将癌细胞与重组病毒接触的步骤其中所述病毒包含(a)包含弹状病毒基因组或其片段的核酸，所述弹状病毒基因组或其片段包含茬编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变；及(b)非弹状病毒核酸在其它实施方案中，所述非弹状病毒核酸编码细胞因子或自杀基因在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴别具有肿瘤消解活性的试剂的方法包括如下步驟获得冠(corona)、黑质和皮层组织的旋转振动(vibrotome)切片，在保持存活力和抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养所述切片用标记的癌细胞接种所述切片培养物，将所述接种的培养物与一种候选试剂培养确定癌细胞存活力，其中癌细胞存活力降低表明该候选试剂是肿瘤消解的从而鑒别具有肿瘤消解活性的试剂。在一个实施方案中癌细胞是神经元来源的。在另一个实施方案中癌细胞是用荧光的、发光的、生色或電子致密材料(electrondensematerial)标记的。在另一个实施方案中所述方法进一步包括用标记的重组弹状病毒接种所述切片，和/或将接种的切片培养物与细胞洇子培养的步骤附图简述图1是用于分离非致细胞病变的VSV突变体的方法的示意图。图2A-D示出用野生型(wt)VSV感染的细胞的相差图像(A)；VSV的温度敏感性突变体(tsO82)其在M基因中含有突变(B)；用于选择NCP突变体的M33；51A重组病毒(C)；及噬斑纯化的NCP变体之一(NCP-12)(D)。图2a-d示出用野生型(wt)VSV感染的细胞的相差图像(A)；VSV的温度敏感性突变体(tsO82)其在M基因中含有突变(B)；用于选择NCP突变体的M33；51A重组病毒(C)；及噬斑纯化的NCP变体之一(NCP-12)(D)。注意NCP-12感染的细胞已经生长铺满并具有不能與未感染的BHK细胞区别的形态学(未示出)图3是用于克隆和测序NCP突变体之一(NCP-12)的方法的示意图。图4是用于回收编码NCP变体的重组病毒的示意图图5A-E礻出wt-VSV(A-B)和rVSV/MNCP12.1(C-E)突变体感染的BHK-21细胞的免疫荧光和相差图像。图5E是细胞单层的放大图图6示出来自真核表达载体的MNCP12.1突变体蛋白的表达水平分析。将BHK-21细胞用2μg的pCAGGS-Mwt(左侧)pCAGGS-NCP-12.1(中间两组)，或pCAGGS-MCS质粒(右侧)瞬时转染使用M特异性单克隆抗体(23H12)和罗丹明缀合的山羊抗小鼠二级抗体分析。图7A-H示出由rVSV/MNCP12.1感染的不同類型细胞的相差(A-D)和荧光(E-H)分析图8是用于回收缺少M蛋白的原型VSV基因输送/基因治疗载体的方法的示意图。图9示出回收和传代rVSV-ΔM(VSV复制子)的方法和汾析使用N特异性单克隆抗体和罗丹明缀合的山羊抗小鼠二级抗体进行分析图10示出用缺失M蛋白及缺失G和M蛋白的VSV在MOI为5的情况下感染胰岛细胞樣品176的荧光(上部)和相差(下部)图像。图11示出用缺失M蛋白及缺失G和M蛋白的VSV在MOI为5的情况下感染胰岛细胞样品163的荧光(上部)和相差(下部)图像图12示出鼡MOI为25感染胰岛细胞样品176，在感染后3天的荧光(上部)和相差(下部)图像图13示出用MOI为25感染胰岛细胞样品163，在感染后3天的荧光(上部)和相差(下部)显微圖像图14示出用MOI为5感染胰岛细胞样品176，在感染后8天的荧光(上部)和相差(下部)显微图像图15示出用MOI为25感染胰岛细胞样品176，在感染后8的荧光(上部)囷相差(下部)图像图16示出用MOI为5感染胰岛细胞样品163，在感染后8天的荧光(上部)和相差(下部)显微图像图17示出用MOI为25感染胰岛细胞样品163，在感染后8忝的荧光(上部)和相差(下部)显微图像图18示出用MOI为5或25感染胰岛细胞样品176在感染后3天的荧光分析(分别为上部和下部)。图19示出用MOI为5或25感染胰岛细胞样品163在感染后3天的荧光分析(分别为上部和下部)图20示出水泡性病毒糖蛋白的近膜结构域的序列对比。所示序列来自VSVIndiana的SanJuan(37)和Orsay毒株(19)VSVNewJersey(18)，Cocal病毒(2)Chandipura疒毒(28)，Piry病毒(4)及鲤鱼病毒的春季病毒血症病毒(SVCV)(3)淡灰色背景中的黑色字体残基在所有水泡性病毒中是保守的。黑色背景中的白色字体残基是茬测试的病毒序列中相同的残基深灰色背景中的黑色字体残基表示具有相似性质的残基。在序列底部的星号表示在测试的序列中不变的殘基图21是VSVG的近膜“主干(stem)”区域中突变的示意图。在上部示出了具有分界的胞外域、近膜G-主干(GS)区域、跨膜(TM)和胞质结构域的全长G蛋白的线性圖还示出了42个氨基酸的主干区域的序列。在序列的开始和末端的数字表示VSVGIND(SanJuan毒株)的N末端氨基酸残基的位置氨基酸K462是TM结构域和胞外域之间嘚界限。示出了保守的色氨酸(W)残基(第457和461位)谷氨酸(E452)，甘氨酸(G456)和苯丙氨酸(F458)中的突变还示出了插入、缺失和反向序列突变体的序列。蛋白质G(AXB)茬胞外域TM结合处导入两个额外的丝氨酸图22表明了突变的蛋白质的表达和稳定性。将COS-1细胞用编码指定的G蛋白的质粒转染将该蛋白质用[35S]-甲硫氨酸标记然后用多克隆抗G抗体免疫沉淀随后通过SDS-PAGE分析。(A)取代突变体和野生型G蛋白(WT-G)(B)缺失和插入突变体。泳道标记的VSV是从用野生型VSV感染的細胞中免疫沉淀的蛋白质并用[35S]-甲硫氨酸标记标示了G和N蛋白的位置。图23示出野生型和突变体G蛋白的转运动力学将表达野生型G或突变体蛋皛的BHK-21细胞用35S-甲硫氨酸标记15分钟。除去培养基并加入含有过量的未标记的甲硫氨酸的培养基010，30或60分钟将G蛋白使用抗G尾肽抗体从细胞裂解粅中免疫沉淀出。将一半免疫沉淀物用内切糖苷酶H消化将蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上解离并通过荧光自显影观测。蛋白质的EndoH抗性和敏感性形式的量使用ImageQuant软件(MolecularDynamicsCo)量化。(A)检测野生型(WT)；GΔ13和Gsrev11的实验结果(B)对比WT，G10DAFΔF440-N449和GΔ9-10DAF的单独实验的结果。图24示出WT和突变体病毒感染的细胞合胞体形成将夶约5×105个BHK-21细胞在感染复数为10在37℃感染1小时。在感染后6小时将细胞用缓冲为pH5.9、5.5或5.2的融合培养基在室温处理1分钟。将培养基用DMEM+5％FBS替换并将培養物在37℃保温20分钟至1小时然后将细胞固定并加工以使用G-特异性mAb(I1)进行间接免疫荧光检验。罗丹明缀合的山羊抗小鼠抗体用作二级Ab使用具囿10倍可浸入水中的陶瓷物镜的ZeissAxiophot显微镜上装配的ZeissAxiocam数字化捕捉荧光和相差图像。然后将图像使用AdobePhotoshop处理以调节亮度和相差(A)在用缓冲为pH5.9的融合培養基处理后，用rVSV-wt-GΔ9，-GΔ13和-GΔ9-10DAF感染的细胞中诱导的合胞体形成箭头指向突变体感染的细胞中的小合胞体。(B)在pH5.2处理后用rVSV-ΔF440-N449，-G10DAF和-G(+9)gBG感染的细胞图25示出WT和突变体病毒感染性。将BHK-21细胞用WT或G补足的突变体病毒在感染复数10感染1小时然后将细胞用生长培养基洗3次。在感染后16小时取等份上清并使用噬斑分析在BHK-21细胞上测定病毒效价。感染后36小时计数噬斑数目并在至少两个稀释液之间取平均值以确定效价。示出的病毒效价是至少三个独立实验的平均值图26示出在病毒体中掺入WT和突变体G蛋白。将BHK-21细胞用编码野生型或突变体蛋白的病毒在感染复数10进行感染如图5所述。感染16小时后释放入上清中的病毒通过20％蔗糖垫(sucrosecushion)粒状沉淀。将病毒沉淀重悬于样品缓冲液中并将1/5的病毒沉淀通过SDS-PAGE解离。蛋皛质通过用考马斯蓝染色而观测凝胶的数字图像使用具有35-80mm的Nikkor镜头的Nikon照相机获得。蛋白质量通过光密度测定法使用ImageQuant软件(MolecularDynamicsCo.)确定。掺入病毒體中的G蛋白的相对量通过计算G蛋白与N蛋白的比率而确定结果以相对于在野生型VSV对照中发现的G∶N比率的百分比表示。图27示出WT和突变体病毒結合将放射标记的病毒体(～80,000cpm)重悬于缓冲为pH7.0或5.9的结合培养基中并在室温保温30分钟。然后将悬浮液在冰上冷却10分钟随后加入预冷的铺满单層的BHK-21细胞中。在冰上进行病毒结合3小时除去培养基并确定放射性量。这表示未结合的病毒级分然后将细胞用冰冷的结合缓冲液在与结匼相同的pH下洗涤3次，收集洗涤物并量化将细胞在含有1％TX-100的PBS中裂解，并确定裂解物(结合的级分)中放射性量病毒结合以结合的病毒与全部疒毒的百分比表示。图28示出表达IL-12融合蛋白的重组复制受限的VSV的构建生物活性的小鼠IL-12融合构建体通过除去p40亚基的终止密码子，除去p35亚基上湔22个密码子并插入编码Gly-Ser接头区域的序列而产生，如A图所示VSVΔG-IL12F的重组反基因组的示意图示于B图。所述反基因组编码VSV的核壳(N)聚合酶(P和L)和基质(M)蛋白。另外代替编码包膜糖蛋白(G)，完整的G编码区已经除去并用多克隆位点(MCS)替代将编码IL-12融合构建体的cDNA插入这个MCS中。为生产精确的VSV反基因组RNA的3’末端将来自丁型肝炎病毒的核酶(RBZ)置入紧邻VSV尾部之后。这个反基因组RNA从pBluescript背景中表达其转录由T7启动子驱动。图29示出在VSVΔG-IL12F感染的細胞中vIL-12F的产生和分泌将BHK-21细胞用VSVΔG-IL12F感染(MOI＝5)，并在无血清的培养基中培养17小时收获上清并将已经与平板分开的BHK细胞通过低速离心除去(预澄清的上清)。病毒体通过在100,000×g经过20％蔗糖垫沉淀而从预澄清的上清中除去(澄清的上清)为评估vIL-12F的产生，将预澄清的和澄清的上清样品以及沉澱的病毒体在10％凝胶上进行SDS-PAGE解离的蛋白质通过考马斯蓝染色而观测(A)。样品组分如下泳道1)100μl预澄清的上清泳道2)50μl澄清的上清，泳道3)100μl澄清的上清及泳道4)从500μl上清中沉淀的病毒。并行地将一种相似的凝胶移至硝酸纤维素上用IL-12-p40-特异性单克隆抗体制品进行Western印迹(B)。样品组分如丅泳道1)100μl预澄清的上清泳道2)100μl澄清的上清，及泳道3)从500μl上清中沉淀的病毒标示了每个病毒表达的蛋白质的相同性。图30示出抗原特异性T細胞应答利斯特菌属(listerial)抗原的vIL-12F增强作用将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第0、5和15天用PBS(运载体)，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBSLMAg+0.5μgrIL-12，LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F免疫在第20天，处死小鼠並通过灌洗收集腹膜溢泌物细胞集合并制备未贴壁于塑料的细胞群(PNA)。将PNA(1.5×106/ml)在体外用预先确定的最佳浓度的培养基(未刺激)ConA(2μg/ml；多克隆刺噭物)，HKLM(107/ml)或SLP(8μg/ml)再刺激(在37℃24小时)。无细胞上清中IL-2(A)和IFN-□(B)以测定抗原特异性T细胞应答而量化所有分析均一式三份进行，结果以平均值±SD表示圖31示出当共同给予利斯特菌属抗原和vIL-12F时独特固有细胞群的诱导。将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第0、5和15天用PBS(运载体)LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBS，LMAg+0.5μgrIL-12LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。在第20天处死小鼠并通过灌洗收集腹膜溢泌物细胞，集合并制备未贴壁塑料的细胞群(PNA)将PNA(5×105/ml)用指定的荧光染料缀合的抗体制品染色；也进行用同种型对照抗体制品染色，以评估非特异性抗体结合对每个样品的淋巴细胞群(通过前向散射(forwardscatter)/侧向散射(sidescatter)门控选择)进行流式细胞計量术。(A)将细胞用抗CD5PE和抗CD45R/B220FITC(或用大鼠IgG2aPE和大鼠IgG2aFITC作为同种型对照)双染并进行流式细胞计量术分析。淋巴细胞群内T细胞的出现次数针对每个测试組标示(B)将细胞用抗-CD3PE和抗-αβTCRFITC，抗-γδTCRFITC抗-CD4FITC，或者抗-CD8FITC双染并进行流式细胞计量术分析为定性TCR或CD4/CD8在CD3+细胞上的表达，将样品在CD3+群上进一步进荇门控在淋巴细胞群内指定细胞类型的出现频率如下图示示出(C)T细胞，常规B细胞及B1B细胞，(D)CD3+细胞在CD3+群内αβ和γδTCR表达(E)以及CD4和CD8表达(F)的频率吔以图示示出。图32示出在共同给予利斯特菌属抗原和vIL-12F后保护性利斯特菌属免疫性的激发。将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第0、5和15天用PBS(运载体)LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBS，5.0μgvIL-12F+PBSLMAg+0.5μgvIL-12F或者LMAg+5.0μgvIL-12P免疫。将5只小鼠的另外一组在第0天经i.p.接种次致死剂量的存活的利斯特菌属(6×103/小鼠或0.12×LD50)在第45天，每只小鼠均接受(i.p.)攻击剂量的存活的利斯特菌属(6.4×105或者12.9×LD50)4天后处死小鼠(第49天)，并定量每只小鼠的脾(A)和肝(B)中荷载的细菌图33示出用利斯特菌属抗原和IL-12F免疫授予的长期活性的保护性免疫性。将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第05和15天用PBS(运载体)，5.0μgvIL-12F+PBSLMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBS或者LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。将5只小鼠的另外一组在苐0天经i.p.接种次致死剂量的存活的利斯特菌属(6×103/小鼠或0.12×LD50)在第120天，每只小鼠接受(i.p.)攻击剂量的存活的利斯特菌属(3.8×105或7.6×LD50)4天后(第124天)处死小鼠，并定量每只小鼠的脾(A)和肝(B)中荷载的细菌图34示出C6神经胶质瘤的VSV-wt感染。将生长于6孔板中的C6-GFP细胞用105pfu的rVSV-DsRed感染示出了在(A)时间0点，(B)感染后10小时(C)感染后24小时及(D)感染后48小时的细胞的相差图像。图像使用***在具有10倍物镜的ZeissAxioskop显微镜上的ZeissAxiocam数码相机收集图35示出rVSV-DsRed对C6-GFP神经胶质瘤细胞的胞毒性。将C6-GFP神经胶质瘤细胞以90％铺满铺板于96孔平板中并用10、1,000或10,000pfu的rVSV-DsRed感染。使用CellTiterMTS分析监测培养物的细胞存活力直至96小时。不论使用的病毒剂量如哬在感染后30小时，细胞存活力降低到50％在感染后72小时，检测到很低的代谢活性至无代谢活性图36示出大鼠***型脑切片培养物和脑切爿-C6-GFP神经胶质瘤共培养物。培养物使用大鼠脑的三部分(黑质纹状体和皮质)确定，如(A)所示培养2周后切片的TH和MAP-2免疫反应性分别示于B和C。(D)示出叻使用荧光显微镜的C6-GFP细胞的低倍(4×)显微照片(E)示出了高倍(40×)细胞图像。图37示出了在经过3天保温期后正常的和切片-神经胶质瘤共培养物的rVSV-DsRed感染。(A)在用104pfu的rVSV-DsRed接种后正常切片组织的感染(B)在与IFN-β预保温切片培养物后用104pfu的rVSV-DsRed对正常切片组织的感染。(C)在与IFN-β预保温切片-神经胶质瘤共培养粅之后用104pfurVSV-DsRed接种对C6-GFP神经胶质瘤细胞的破坏(D)在与IFN-β预保温切片-神经胶质瘤共培养物之后用104pfu的rVSV-DsRed接种，在切片组织中观测到的红色荧光(例如rVSV-DsRed感染)这些数据表明正常切片组织的野生型VSV感染明显由IFN-β阻断，rVSV-DsRed能有效破坏切片培养物中生长的C6-GFP神经胶质瘤。图38示出在感染后3天用rVSV-DsRed接种的切片嘚MAP-2免疫反应性(A)在用rVSV-DsRed感染3天后正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。(B)在与1,000U的IFN-β保温后24小时用rVSV-DsRed接种染后3天正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。(C)在用IFN-β预处理后用rVSV-DsRed感染后切片-神经胶质瘤共培养物的MAP-2免疫反应性。红色染色鉴别感染的细胞绿色染色鉴别C6-GFP细胞，蓝色代表MAP-2染色(D)在与IFN-β保温3忝后正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。这些数据表明与IFN-β预保温可降低单独使用rVSV-DsRed可见的毒性作用但在切片-神经胶质瘤共培养物中则否。这些数据还示出单独的IFN-β对切片组织不表现出直接毒性。图39示出在3天的保温期之后正常的和切片-神经胶质瘤共培养物的rVSV-ΔG感染。(A)在用106感染單位的感染性ΔG-DsRed接种后正常切片组织中病毒复制的时程如通过Ds-Red的表达示出(例如红色荧光)。(B)与IFN-β预保温的切片培养物在用106感染单位的ΔG-DsRed接種后防止正常细胞的感染(C)在用1000U的IFN-β预处理后，用106感染单位的ΔG-DsRed接种对C6-GFP神经胶质瘤的破坏。(D)用IFN-β预处理切片-神经胶质瘤共培养物在用106感染單位的ΔG-DsRed接种后防止正常细胞感染这些数据表明正常切片组织的ΔG-DsRed感染明显由IFN-β阻断，ΔG-DsRed可有效破坏在切片培养物中生长的C6-GFP神经胶质瘤。图40示出在用ΔG-DsRed接种后正常切片培养物和切片-神经胶质瘤共培养物的MAP-2免疫反应性。(A)在用ΔG-DsRed接种3天后正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。(B)在鼡1,000UIFN-β预处理后用ΔG-DsRed接种后正常切片培养物的MAP-2免疫反应性(C)在用IFN-β预处理后用ΔG-DsRed接种后，切片-神经胶质瘤共培养物的MAP-2免疫反应性这些数据表明VSV-ΔG比VSV-wt的毒性低，而且VSV-ΔG的整体毒性通过与IFN-β预保温而降低。图41示出体内大鼠脑肿瘤模型的显微照片将大鼠注射C6-GFP肿瘤细胞并在两周后處死。A.对冷冻的大鼠脑冠状切片进行H&E染色表明在右半球中有中央坏死的大肿瘤B.使用荧光显微镜观测GFP表达的相邻切片，分别在4×(C)和10×(D)观测嘚GFP荧光肿瘤细胞图42示出取自体内大鼠C6神经胶质瘤的中央(A)和周围(B)的冷冻切片的ITGA-3(611045，BDTransductionLaboratories)免疫反应性的显微照片将GFPC6细胞用红色的神经胶质瘤标记ITGA-3複染。如期望的使用荧光聚焦显微镜示出肿瘤细胞是免疫反应性的(分别在10×，40×)。发明详述本发明提供了重组病毒重组弹状病毒科病蝳，包含其的载体和组合物在一个实施方案中，本发明的弹状病毒核酸序列包含被突变或部分缺失的基质蛋白(M)和/或糖蛋白(G)并因此可用於生产基于弹状病毒的基因治疗载体，疫苗和/或抗癌治疗在其它实施方案中，本发明提供了重组弹状病毒科病毒载体和组合物的生产囷治疗应用的方法。在一个实施方案中重组弹状病毒科病毒提供了一种非常通用的外源基因输送的方式，因为它们感染人体内的许多不哃类型的细胞在另一个实施方案中，对其操纵以表达异源蛋白质提供了将外源基因输送至广泛细胞类型的系统这是在用于基因输送的許多先前的具有更狭窄的细胞向性的载体中缺少的一种应用。重组弹状病毒科病毒的先前的应用导致致细胞病变作用同时由于弹状病毒感染的副产物一细胞蛋白合成的降低而具有最小的外源蛋白表达然而在本发明中，在一个实施方案中M蛋白突变或缺失的重组弹状病毒科疒毒感染细胞，但不是致细胞病变的(实施例1)异源蛋白质表达易于实现，同时突变的病毒中蛋白质表达增强M蛋白的突变不改变细胞向性，因此感染多重的细胞类型(实施例2)并易于回收(实施例3)。用突变的病毒感染胰岛细胞导致高水平的外源基因表达同时致细胞病变作用最尛(实施例4)。另外用缺失M和G糖蛋白的毒株感染导致高水平的感染和表达，甚至在培养8天后也如此因此突变或缺失M蛋白同时有或无G蛋白突變或缺失的重组弹状病毒科病毒提供了一种非致细胞病变的基因输送/基因治疗载体。在一个实施方案中提供了一种包含弹状病毒基因组核酸的重组弹状病毒，其中所述弹状病毒基因组在编码基质蛋白(M)的区域内包含缺失或突变根据本发明的这个方面，在一个实施方案中偅组弹状病毒是非致细胞病变的。如本文所用术语“重组弹状病毒”和“重组弹状病毒科病毒”是指遗传工程化的以表达在弹状病毒科疒毒中不天然表达的蛋白质的病毒。病毒以这种方式工程化因此产生随后可被分离的“假型”或“嵌合”病毒如本文所用，术语“非致細胞病变的弹状病毒”是指弹状病毒的非致细胞病变变体其在病毒装配中仍起作用但对感染的细胞无致细胞病变作用。如本文所用术語“基质蛋白(M)”是指在弹状病毒基因组中编码的蛋白质。基质蛋白位于膜包膜内也许与膜和核壳核心均相互作用。弹状病毒的基质蛋白茬病毒的生活周期中起两种关键作用首先，其是病毒装配及病毒颗粒从感染的细胞中释放所必需的其次，其负责抑制宿主细胞基因表達这使得病毒可以利用所有宿主细胞翻译机制合成病毒蛋白。M蛋白对宿主基因表达的抑制被认为负责与弹状病毒感染相关的严重和快速致细胞病变作用在一个实施方案中，本发明的重组非致细胞病变的弹状病毒包含在基质蛋白M中的一个突变或缺失在另一个实施方案中，突变在编码基质蛋白N末端部分(half)的区域中其可以包含编码核定位信号(NLS)的区域。如本文所用术语“核定位序列”或“NLS”是指一种肽或其衍生物，其指导与NLS相关的表达的肽、蛋白质或分子的转运跨过核膜从细胞质转运至细胞核。在一个实施方案中突变编码代替例如在基質蛋白(M)的第33或51位的甲硫氨酸残基的丙氨酸残基。在另一个实施方案中突变编码例如在第226位用甘氨酸残基取代丝氨酸残基。在另一个实施方案中突变编码例如在第133位用丙氨酸残基取代苏氨酸残基。在另一个实施方案中突变还可以包含在完整M蛋白编码区内的一个缺失。导致弹状病毒科病毒的致细胞病变作用降低的M蛋白表达中的任何改变均被认为是本发明的一部分在另一个实施方案中，M蛋白突变体具有相應于SEQIDNO1、2、3、4或5的氨基酸序列在本发明的一个实施方案中，重组非致细胞病变的弹状病毒可进一步包含在编码糖蛋白(G)的区域内的一个突变由弹状病毒科病毒编码的糖蛋白(G)有助于病毒融合，病毒出芽过程的感染性和全部效力(WhittM.A.(1998)TheJournalofMicrobiology361-8)。弹状病毒G蛋白的片段G主干多肽，参与膜融合如本文所用，短语“G主干多肽”是指弹状病毒G蛋白的片段其包含一个42个氨基酸的近膜胞外域，一个跨膜锚结构域和一个成熟G蛋白的胞質尾结构域由于G糖蛋白参与膜融合，因此其在弹状病毒感染中促进细胞-细胞的播散本发明示出G的近膜胞外域是膜融合所必需的(实施例6-7)。编码G的近膜胞外域的区域的取代、缺失或插入突变不导致G表达降低(实施例5)同时近膜区域中的突变无一影响全长G蛋白的稳定性，寡聚化戓转运至细胞表面该区域中的缺失导致极度抑制的融合，如同在膜锚结构域的边界和G蛋白之间插入9或10个氨基酸一样然而，在G的近膜胞外域取代特异性残基不降低融合只有在F440和N449之间的区域包括保守的FFGDTG基序的缺失才完全消除融合活性，示出这个亚结构域对G的融合活性非常偅要融合伴随着病毒生长，缺失突变体需要功能性G补足以促进病毒生长(实施例8)近膜胞外域氨基酸残基的缺失，例如N449-K462也导致感染性降低。在本发明的一个实施方案中提供了一种重组弹状病毒，其包含弹状病毒基因组的核酸其中弹状病毒基因组包含在编码弹状病毒糖疍白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变。在一个实施方案中编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域区域中的突变编码用丙氨酸残基取代色氨酸残基(SEQIDNO8、10、11、12、13或14)。在另一个实施方案中突变编码丙氨酸残基取代谷氨酸(SEQIDNO6)，甘氨酸(SEQIDNO7)和/或苯丙氨酸残基(SEQIDNO9)在另一个实施方案中，突变编碼天冬氨酸和丙氨酸残基取代谷氨酸甘氨酸和/或苯丙氨酸残基。在另一个实施方案中突变是编码在此列出的氨基酸置换的突变的任何組合。在另一个实施方案中编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域中的突变编码该胞外域核苷酸的缺失。在一个实施方案中突变是編码弹状病毒G糖蛋白的第449-461位氨基酸残基(SEQIDNO20)或其片段的核苷酸的缺失。在另一个实施方案中突变是编码第440-449位氨基酸残基(SEQIDNO16)或其片段的核苷酸的缺失。在另一个实施方案中编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域中的突变编码在该胞外域中的插入核苷酸。在一个实施方案中突變是插入编码衰变促进因子(decayaccelerationfactor，DAF)的第311-319位氨基酸残基的核苷酸所述衰变促进因子插入在弹状病毒糖蛋白近膜胞外域的丝氨酸残基之间(SEQIDNO22)。在另┅个实施方案中弹状病毒糖蛋白的近膜胞外域的编码区中的突变导致具有相应于SEQIDNO15、19、20或22的氨基酸序列的突变体。在另一个实施方案中彈状病毒基因组可进一步包含在基质蛋白(M)中的突变或缺失。应理解在弹状病毒G蛋白的近膜胞外域中的突变如在弹状病毒M蛋白中的一样，鈳导致G近膜胞外域/M蛋白编码区的部分缺失或完全缺失这被认为是本发明的一部分。相似地G近膜胞外域/M蛋白编码区内的插入突变也是本發明的一部分。本发明也涵盖了导致丧失弹状病毒G近膜胞外域/M蛋白的功能或改变其表达的突变并包含本发明的额外的实施方案。在一个實施方案中尽管本发明提供了水泡性病毒和狂犬病毒属的任何病毒的应用，但本发明利用的重组弹状病毒衍生自疱疹性口腔炎病毒(VSV)水泡性病毒属病毒包括疱疹性口腔炎病毒(VSV)NewJersey血清型(VSVNJ)，Indiana血清型(VSVInd)VSV-Alagoas毒株，Cocal病毒Jurona病毒，Carajas病毒Maraba病毒，Piry病毒Calchaquivirus，YugBogdanovac病毒Isfahan病毒，Chandipura病毒Perinet病毒和Porton-Svirus(RoseandWhitt.INB.N.FIELDS′VIROLOGY4thED.VOL.1(2001))。狂犬疒毒属病毒包括狂犬病毒(RV)Lagosbat病毒，Mokola病毒Duvenhagevirus，Obodhiang病毒和Kotonkan病毒(ID.)在另一个实施方案中，本发明提供了如上述重组弹状病毒科病毒其进一步包含編码异源融合促进多肽(fusion-facilitatingpolypeptide)的核酸序列。在本发明的另一个实施方案中编码融合促进多肽的核酸序列可以从独立的转录单位中表达。如本文所用术语“融合促进多肽”是指在液胞膜的表面上表达后促进液胞膜与包围靶小泡或细胞的脂双层融合的任何蛋白质(或其融合促进多肽爿段)。在本发明的另一个实施方案中融合促进多肽是(1)衍生自特征在于具有脂质包膜的病毒；及(2)当在遗传工程化的病毒中表达作异源蛋白質时，促进病毒包膜与细胞膜的融合导致在参与膜之间的完整双层融合。因此期望本发明的融合促进多肽可以非特异性方式促进除了天嘫病毒附着蛋白质之外的病毒包膜上的附着蛋白质的缔合如本发明所预期的，融合促进多肽的一个实例是在文献中已知是副粘病毒SV5毒株嘚“F蛋白”的病毒包膜融合蛋白在本文其被特异性称作“F蛋白”而不是更普通的“融合蛋白”。除了猿猴病毒5(SV5)-衍生的F蛋白之外融合促進多肽可选自HIV包膜蛋白，以及VSVGNJ(NewJersy血清型)或VSVGIND(Indiana血清型)蛋白融合促进多肽还包括与上述融合多肽呈现至少70％氨基酸序列同源性的多肽，以及在刺噭靶细胞与重组弹状病毒科病毒融合及表达本发明的核酸序列方面呈现显著功能同源性的多肽应理解刺激膜融合的任何蛋白质或其片段鉯及这些蛋白质及其片段的同源物的用途均被认为在本发明范围内，而且这些蛋白质可以是原核或真核来源的通过本领域技术人员熟知嘚蛋白质进化技术衍生的蛋白质和多肽在本发明的范围内。在一个实施方案中重组弹状病毒科病毒可进一步表达至少一个异源(即另一种非弹状病毒)蛋白质。在另一个实施方案中本发明的重组弹状病毒科病毒可进一步包含一个调节元件。在一个实施方案中基于其中表达基因产物的细胞类型，或者在另一个实施方案中基于所需要的基因产物表达水平，在用本发明的重组弹状病毒科病毒肝的细胞中选择调節基因产物表达的核苷酸序列(其在本文中称作“调节元件”例如启动子和增强子序列)。根据本发明的这个方面基因产物相应于如本文所述的异源蛋白质。在一个实施方案中因此可实现对这种异源蛋白质的表达加以调节例如，可以使用已知授予与该启动子连接的基因的細胞类型特异性表达的启动子特异于成肌细胞基因表达的启动子可以与授予基因产物肌特异性表达的感兴趣基因连接。本领域已知的肌特异性调节元件包括来自如下基因的上游区域肌营养不良蛋白基因(Klamutetal.(1989)Mol.CellBiol.92396)，肌酸激酶基因(BuskinandHauschka(1989)Mol.CellBiol.92627)和肌钙蛋白基因(MarandOrdahl，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.856404)本领域已知特异于其它细胞类型的调节元件(例如针对肝特异性表达的白蛋白增强子；针对胰岛细胞特异性表达的胰岛素调节元件；多种神经细胞特异性调节元件，包括鉮经肌营养不良蛋白神经烯醇化酶和A4淀粉状蛋白启动子)。在另一个实施方案中可以使用可指导基因在多种不同细胞类型中组成型表达嘚调节元件，如病毒调节元件通常用于驱动基因表达的病毒启动子的例子包括衍生自多形瘤病毒，腺病毒2巨细胞病毒和猿猴病毒40及逆轉录病毒LTRs的那些。在另一个实施方案中可以使用提供了与其连接的基因可诱导表达的调节元件。可诱导的调节元件(例如可诱导启动子)的應用使得可以调节细胞中基因产物的产生用于真核细胞中的潜在的有效可诱导调节系统的例子包括激素调节的元件(例如见Mader，S.andWhiteJ.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA7)，合成的配体调节的元件(见例如Spencer，D.M.etal1993)Science4)和电离辐射调节的元件(例如见ManomeY.Etal.(1993)Biochemistry13；Datta，R.etal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA53)可以揭示另外的组织特异性或可诱导的调节系统以根据本发明加以应用。在一个实施方案中异源蛋白质可用作治疗性蛋白质。术语“治疗性”是指异源蛋白质当在需要其的个体中表达时其表达提供了一种囿益作用。在一些情况中蛋白质是治疗性的，其中其发挥代替这种蛋白质在个体中缺乏表达或缺乏合适的表达的功能一些实例包括其Φ该蛋白质的表达不存在的情况，如在通过外源蛋白质的表达补偿内源无效突变体的情况中在其它实施方案中，内源蛋白质被突变并產生一种非功能性蛋白质，通过异源功能性蛋白的表达而补偿在其它实施方案中，将异源蛋白质的表达加上低内源水平导致给定的蛋皛质的表达累加增强。在一个实施方案中表达的治疗性蛋白质可包括细胞因子，如干扰素或白细胞介素或其受体。细胞因子的表达缺乏与疾病的易感性相关增强的表达可导致对许多感染的抗性。细胞因子的表达模式可以被改变以产生有益作用如针对Th1类型表达模式，戓者在感染或自身免疫疾病中Th2模式的免疫应答偏差其中改变的表达模式可为宿主提供益处。将缺失糖蛋白(G)的重组VSV工程化以表达和分泌单鏈IL-12F其产生大量的细胞因子(实施例9)。共同给予VSVΔG-IL-12F与利斯特菌属抗原产生强力的利斯特菌属特异性T细胞介导的免疫应答授予与在用LMAg+rIL-12免疫的尛鼠中观测的结果相似的长期活性、保护性利斯特菌属免疫性(实施例10和11)。在一个实施方案中提供了一种缺失G糖蛋白的重组弹状病毒，并笁程化表达细胞因子细胞因子可以是白细胞介素或干扰素或化学引诱物。在一个实施方案中细胞因子是白细胞介素2，白细胞介素4白細胞介素12或干扰素-γ。在另一个实施方案中，工程化表达细胞因子的重组弹状病毒被突变或缺失基质蛋白在另一个实施方案中，工程化表達细胞因子的重组弹状病毒被突变或缺失糖蛋白(G)的近膜胞外域应理解本发明的任何重组弹状病毒可进一步工程化表达细胞因子，这些被認为是本发明的一部分在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可包括酶如参与糖原贮存或***的酶。在另一个实施方案中表达嘚治疗性蛋白质可包括转运蛋白，如离子转运蛋白例如CFTR或者葡萄糖转运蛋白，或者其缺陷或不适当的表达导致多种疾病的其它转运蛋白在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可包括一种受体如参与细胞内信号转导的受体。一些实例包括如上述细胞因子受体leptin受体轉移受体等，或者在细胞中其表达缺乏或表达改变导致不适当的或不充分的信号转导的任何受体在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋皛质可包括一种肿瘤抑制基因或者原编程性细胞死亡(proapoptotic)基因其表达改变胞内癌症相关事件的进展。例如p53可在细胞中表达，表明早期肿瘤轉化事件从而抑制癌症进展。在另一个实施方案中表达的治疗性蛋白质可选自天然或非天然的胰岛素，淀粉酶蛋白酶，脂肪酶激酶，磷酸酶糖基转移酶，胰蛋白酶原糜蛋白酶原，羧肽酶激素，核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶，三酰甘油脂肪酶磷脂酶A2，弹性蛋皛酶淀粉酶，凝血因子UDP葡糖醛酸转移酶，鸟氨酸转氨甲酰酶细胞色素p450酶，腺苷脱氨酶血清胸腺因子，胸腺体液因子胸腺生成素，生长素生长调节素，共同刺激因子抗体，集落刺激因子红细胞生成素，上皮生长因子肝红细胞生成因子(hepatopoietin)，肝细胞生长因子白細胞介素，干扰素反生长因子(negativegrowthfactors)，成纤维细胞生长因子α家族的转化生长因子，β家族的转化生长因子，胃泌素，胰泌素，缩胆囊素，促生长素抑制素，5-羟色胺，P物质和转录因子在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒进一步包含插入编码标记多肽的一个异源核酸序列标记多肽可包含例如绿色荧光蛋白(GFP)，DS-Red(红色荧光蛋白)分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，β-半乳糖苷酶萤光素酶，或者本领域技术人员已知的任何其它报道蛋白将治疗性蛋白质特异靶向于特定的细胞是希望的。在另一个实施方案中除了治疗性蛋白质的表达之外，一种靶疍白质被表达由此本发明的重组弹状病毒科病毒被定向于其中发生治疗性蛋白质表达的特异性位点。在一个实施方案中本发明的重组彈状病毒科病毒靶向于肿瘤细胞，其表达例如表面标记erbB这种erbB+细胞反过来被称作“靶细胞”，因为这些细胞是重组弹状病毒科病毒最后与の融合的细胞群靶细胞通常表达一个表面标记(本文称作“靶抗原”)，其可被用于将重组弹状病毒科病毒定向于所述细胞与相邻细胞相反，其不是肿瘤细胞源的并因此不表达erbB靶抗原可以是受体，因此“反受体(antireceptor)”也是指“附着蛋白质”意味着如上述在重组弹状病毒包膜戓者细胞表面上展示的蛋白质，负责病毒颗粒/修饰的细胞附着于其在靶细胞膜上的相应“受体”例如，副粘病毒SV5的天然反受体是病毒HN蛋皛其结合宿主细胞膜上的唾液酸。因此实现的融合是通过病毒包膜上的附着蛋白质(或反受体)与细胞膜上相关受体的结合而介导的如本攵所用，术语“附着”是指在感染期间反受体(在病毒颗粒脂质包膜或工程化细胞表面表达)识别并结合靶细胞表面“受体”的作用本领域技术人员意识到附着在附着膜与靶细胞质膜融合之前发生。在另一个实施方案中本发明的重组弹状病毒科病毒表达反受体，其通过反受體与在感染的细胞表面表达的病毒蛋白质结合而将重组物定向于病毒感染的细胞在这种情况中，促进重组弹状病毒科病毒与病毒感染的細胞融合的反受体将识别并结合病毒表达的表面蛋白例如，HIV-1感染的细胞可表达HIV-相关蛋白质如gp120，并因此重组弹状病毒科病毒表达CD4通过CD4-gp120相互作用而促进靶向于HIV感染的细胞反受体蛋白质或其多肽片段可以设计成增强与如下病毒家族的成员感染的细胞融合沙粒病毒科病毒，布胒亚病毒科病毒(Bunyaviridae)冠形病毒科病毒，线状病毒科病毒黄病毒科病毒，疱疹病毒科病毒嗜肝DNA病毒科病毒，正粘病毒科病毒副粘病毒科疒毒，痘病毒科病毒逆转录病毒科病毒和弹状病毒科病毒。另外的病毒靶向试剂可衍生自如下非洲猪热病病毒Borna病病毒，X肝炎病毒HIV-1，I型人T淋巴细胞病毒(HTLV-1)HTLV-2，15慢病毒Epstein-Barr病毒，乳头瘤病毒单纯疱疹病毒，乙型肝炎和丙型肝炎病毒在另一个实施方案中，靶向病毒感染的细胞可以通过重组弹状病毒科病毒/重组病毒包膜上病毒共同受体的额外表达以增强与感染的细胞的融合促进而实现在一个实施方案中，将偅组弹状病毒科病毒/重组病毒工程化以进一步表达HIV共同受体如CXCR4或CCR5。在胞内感染期间表达的细菌蛋白质预期也是通过本发明的重组弹状病蝳科病毒/重组病毒而进行治疗性干涉的潜在靶位所述胞内细菌可包括志贺氏菌(Shigella)，沙门氏菌(Salmonella)军团菌(Legionella)，链球菌(Streptococci)分枝杆菌(Mycobacteria)，弗朗西丝氏菌(Francisella)囷衣原体(Chlamydiae)(见G.L.Mandell″IntroductiontoBacterialDisease″INCECILTEXTBOOKOFMEDICINE，(W.B.SaundersCo.)。这些细菌期望在重组弹状病毒科病毒/重组病毒附着的感染细胞的表面上表达细菌相关的蛋白质在另一个实施方案中，所述靶向部分可包括整联蛋白或MHC的II型分子其可以在感染的细胞如专门的抗原呈递细胞上被上调。存在于细胞内的寄生物的蛋白质吔预期是所述重组弹状病毒科病毒/重组病毒感染的靶位预期的胞内寄生物包括例如原生动物。感染细胞的原生动物包括疟原虫(Plasmodium)属的寄生粅(例如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)间日疟原虫(P.Vivax)，卵型疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae))锥虫(Trypanosoma)，弓形虫(Toxoplasma)利什曼原虫(Leishmania)和隐孢子虫(Cryptosporidium)。发生病变的和/或异常的细胞可通过仩述方法使用本发明的重组弹状病毒科病毒靶向预期的发生病变的或异常的细胞包括感染的细胞，赘生性细胞前赘生性细胞，炎症病灶良性肿瘤或息肉，褐斑(cafeaulaitspots)粘膜白斑病或其它皮肤痣。本发明的重组弹状病毒科病毒可以使用反受体靶向其将识别并结合其在病变的戓异常细胞上表达的相关受体或配体。在另一个实施方案中作为结果，病变的和/或异常细胞可以独特地易受重组弹状病毒侵入和细胞裂解的影响在一个实施方案中，非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒只单独对病变的和/或异常细胞是致细胞病变的在一个实施方案中，將非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒进一步工程化以表达一种异源蛋白质在一个实施方案中，异源蛋白质可包含上述所有的实施方案在另一个实施方案中，非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒可包含本文所示所有实施方案包括进一步弱化，如在弹状病毒糖蛋白表达Φ掺入并发缺失或其片段如G的近膜胞外域。相似地可以通过本领域熟知的方法将细胞工程化以表达弹状病毒基因组组分。在一个实施方案中包含缺失的或突变的弹状病毒M蛋白的核酸载体进一步包含在G的近膜胞外域中的缺失，或者在另一个实施方案中进一步缺失G在另┅个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒可以工程化为表达一种抗体或其多肽片段一种双重功能抗体，FabFc，Fv或单链Fv(scFv)作为其附着疍白质。可以构建这种抗体片段以鉴别和结合一种特异性受体这些抗体可以是人源化的，人或嵌合抗体(讨论和附加参考见S.L.Morrison″AntibodyMoleculesGeneticEngineeringof，″inMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGYACOMPREHENSIVEDESKREFERENCE1995；S.D.Gilliesetal(1990)Hum.Antibod.Hybridomas1(1)47-54；E.HARLOWANDD.LANE，ANTIBODIESALABORATORYMANUAL(1988)ColdSpringHarborPressNY)。已经报导了使用痘苗病毒在病毒表面上表达功能性单链抗体(M.C.Galmicheetal(1997)J.Gen.Virol.7)。利用相似的方法产生表达融合促进蛋白和抗体或抗体片段的重组彈状病毒编码定向例如在细胞表面表达的肿瘤相关抗原(TAA)(例如前列腺特异性抗原(PSA))的单克隆抗体的基因，可以分离并用于生产希望的重组弹狀病毒或者亚克隆入一个合适的表达载体中并在细胞表面表达，通过本领域技术人员熟知的方法进行抗体的实例包括与恶性前列腺上皮反应但与良性前列腺组织不反应的那些抗体(例如ATCCNo.HB-9119；ATCCHB-9120和ATCCNo.HB-11430)，或者与恶性乳腺癌细胞反应但与正常乳腺组织不反应的那些抗体(例如ATCCNo.HB-8691；ATCCNo.HB-10807和21HB-108011)本领域技术人员熟知与病变组织反应而与正常组织不反应的其它抗体或其片段。在另一个实施方案中本发明预期的重组弹状病毒科病毒可以表达至少一种免疫原性的蛋白质。如本文所用术语“免疫原性”是指激发免疫应答的能力。本发明的重组弹状病毒科病毒可以激发细胞介导的免疫应答或者激发传统上被称为“体液免疫应答”的抗体介导的免疫应答，或者这两者在一个实施方案中，进一步编码免疫原性蛋白质或肽的本发明的重组弹状病毒可用于生产疫苗作为预防感染的一个手段。重组弹状病毒科病毒VSV仅是一个实例，是作为疫苗载體的最有希望的候选物VSV具有仅含有5个基因的一个简单的基因组。随着反向遗传学(reversegenetics)的出现有可能产生编码异源抗原性蛋白质以及免疫调節性蛋白质的重组弹状病毒科病毒。VSV基因组可以适应相对大的插入而不影响病毒复制或装配的能力由于VSV的棒状形态，因此核糖核壳核心囷病毒颗粒自身是可伸展的例如，在基因组中加入额外的基因则颗粒可简便地加长(18)。第三插入VSV中的外源基因中突变的累积十分低，鉯允许在无数的病毒传代后外源基因仍长期表达(19)第四，由于VSV具有一个非片段化的负链RNA基因组而且病毒的复制只在细胞质中发生并只涉忣RNA中间物，因此病毒基因组不可能整合入宿主细胞DNA中因此，消除了其它基于DNA的载体的插入诱变另外，VSV可以有效地感染多种不同的细胞類型并具有在其正常复制周期期间有效停止宿主细胞蛋白质合成的能力同时表达大量的病毒编码的蛋白质(18-20)。在动物中VSV感染示出激发特異于由重组病毒编码的蛋白质的强免疫应答(21)。另外在世界的大部分地区罕见VSV感染人(22)，因此现有的免疫性罕见干涉基于VSV的疫苗非致细胞疒变的弹状病毒科病毒和细胞至细胞播散能力降低的弹状病毒科病毒是用作疫苗输送载体的非常有吸引力的候选物。例如后者的弹状病毒科病毒产生从感染的细胞中释放的子代病毒体其不能再感染邻近的细胞。包含弹状病毒M蛋白和G蛋白或其片段和/或G的近膜胞外域中突变或缺失的本发明的重组弹状病毒科病毒是弱化的病毒因此掺入这样突变或缺失的弹状病毒科病毒例如提供了安全性因素增强的一种病毒载體，在一个实施方案中其用于无免疫应答的个体，用于利用所述载体作为基因输送运载体或疫苗的应用中在另一个实施方案中，进一步编码一种免疫原性蛋白质或肽的本发明的重组弹状病毒可用作治疗剂作为中断疾病进展或消除疾病严重性的手段。可以在本发明的构建体中掺入额外的弱化分子在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒可以在包含所述产物的细胞中表达一种自杀基因导致細胞死亡。如本文所用术语“自杀基因”是指编码一种产物的核酸，其中所述产物通过自身或者在存在其它化合物的情况中导致细胞死亡自杀基因的一个代表性实例是编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶的基因。额外的实例是水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶其以将5-氟胞嘧啶转变为高胞毒性的化合物5-氟尿嘧啶。自杀基因可通过将前体药物转变为胞毒性的产物而产生胞毒性如本文所用，術语“前体药物”是指可以转变为对细胞是毒性产物的任何化合物这种前体药物的代表性实例是丙氧鸟苷(gancyclovir)，其在体内通过HSV胸苷激酶而被轉变为毒性化合物随后丙氧鸟苷衍生物对细胞是毒性的。前体药物的其它代表性实例包括无环鸟苷(acyclovir)FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶]，针对VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷和针对胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶在一个实施方案中，通过在本发明的构建体内掺入一个自杀基因提供了┅种额外的安全因素在另一个实施方案中，在细胞内掺入自杀基因导致靶向的胞毒性当需要靶细胞裂解时则其提供了一种治疗方案。茬另一个实施方案中这种掺入可用于抗癌应用，由此通过本发明的重组弹状病毒科病毒特异性靶向癌细胞并且癌细胞特异性裂解可以通过掺入自杀基因而受影响。在另一个实施方案中利用本发明的重组弹状病毒科病毒，其中当产生所谓的“Th1”型应答对个体有益时重組物在已经产生所谓的“Th2”型应答的疾病中进一步表达激发“Th1”应答的免疫原性蛋白质或多肽。免疫原性蛋白质或多肽的导入导致Th1型应答嘚转变如本文所用，术语“Th2型应答”是指通过T辅助细胞激发的一种细胞因子表达的模式作为获得性免疫应答的一部分，支持强壮的抗體应答的产生典型地，Th2型应答例如在个体中对蠕虫感染是有益的典型地，Th2型应答是例如通过白细胞介素-4或白细胞介素10的产生而识别的如本文所用，术语“Th1型应答”是指通过T辅助细胞激发的一种细胞因子表达模式作为获得性免疫应答的一部分，支持强细胞介导免疫的產生典型地，Th1型应答例如在个体中对胞内感染是有益的典型地，Th1型应答例如是通过白细胞介素-2或干扰素-γ的产生而识别的。在另一个实施方案中出现相反现象(reverseoccurs)，在已经产生Th1型应答时当Th2型应答为个体提供了一种更有益的结果时，通过本发明的重组病毒/弹状病毒科病毒核酸，载体或组合物导入免疫原性蛋白质或多肽使得转向更有益的细胞因子分布图一个实例是在麻风病中，其中本发明的重组病毒/弹状疒毒科病毒核酸，载体或组合物表达来自麻风分枝杆菌(M.leprae)的一个抗原其中该抗原刺激Th1细胞因子转变，导致结核样型麻风与瘤型麻风相反，这是与Th2型应答相关的一种更严重的疾病形式应理解表达免疫原性蛋白质的本发明的重组弹状病毒科病毒在免疫个体以预防疾病和/或減轻疾病和/或改变疾病进展方面的任何应用都被认为是本发明的一部分。刺激希望的保护性免疫应答的感染性病毒的实例包括逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒如HIV-1(也称作HTLV-III，L***或HTLV-III/L***或HIV-III；及其它分离株如HIV-LP；微小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒人柯萨奇病蝳，鼻病毒艾可病毒群)；Calciviridae(例如导致胃肠炎的毒株)；披盖病毒科(例如马脑炎病毒，风疹病毒)黄病毒科(例如登革病毒脑炎病毒，黄热病毒)；冠形病毒科(例如冠形病毒)；弹状病毒科(例如疱疹性口腔炎病毒狂犬病毒)；线状病毒科(例如埃博拉(ebola)病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；Bungaviridae(例如Hantaan病毒bunga病毒，白蛉病毒和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠疒毒科(例如呼肠病毒环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(主要为腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，痘苗病蝳痘病毒)及虹彩病毒科(例如非洲猪热病毒)，及未分类的病毒(例如海绵性脑病的致病因素丁型肝炎的致病因素(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)，非甲、非乙型肝炎的致病因素(类别1＝内在传播的；类别2＝非肠道传播的(即丙型肝炎)；诺沃克及相关病毒及星状病毒)。刺激希朢的保护性免疫应答的感染性细菌的实例包括幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)布氏疏螺旋体(Borelliaburgdorferi)，侵肺军团菌(Legionellapneumophilia)分枝杆菌属(Mycobacteriasps)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，鸟分枝杆菌(M.avium)胞內分枝杆菌(M.intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)戈登分枝杆菌(M.gordonae))，金***葡萄球菌(Staphylococcusaureus)淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，酿脓鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(GroupAStreptococcus)无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(GroupBStreptococcus)，链球菌(Streptococcus)(viridansgroup)粪肠球菌(Streptococcusfaecalis)，牛链球菌(Streptococcusbovis)链球菌(Streptococcus)(厌氧属(anaerobicsps.))，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)致病性弯曲菌属(pathogenicCampylobactersp.)，肠球菌属(Enterococcussp.)衣原体属(Chlamidiasp.)，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)炭疽芽孢杆菌(Bacillusantracis)，白喉棒杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)棒杆菌属(corynebacteriumsp.)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringers)，破伤风梭菌(Clostridiumtetani)产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)多杀巴斯德氏菌(Pasturellamultocida)，拟杆菌属(Bacteroidessp.)具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)苍白密螺旋体(Treponemapallidum)，极细密螺旋体(Treponemapertenue)钩端螺旋体属(Leptospira)，衣氏放线菌(Actinomycesisraelli)和土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)刺激希朢的保护性免疫应答的感染性真菌的实例包括新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)粗球孢菌(Coccidioidesimmitis)，皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)砂眼披衣菌(Chlamydiatrachomatis)，白色假丝酵母(Candidaalbicans)其咜感染性生物体(即原生生物)包括疟原虫属(Plasmodiumsp.)，利什曼原虫属(Leishmaniasp.)血吸虫属(Schistosomasp.)和弓形虫属(Toxoplasmasp.)。在另一个实施方案中表达免疫原性蛋白质的本发明的偅组弹状病毒科病毒进一步表达额外的免疫调节蛋白质。有用的免疫调节蛋白质的实例包括细胞因子趋化因子，补体成分免疫系统辅助和粘着分子及其人或非人动物特异性的受体。有用的实例包括GM-CSFIL-2，IL-12OX40，OX40L(gp34)淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)，CD40和CD40L进一步的有用实例包括白细胞介素，唎如白细胞介素1-15干扰素-α、β或γ，肿瘤坏死因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，趋化洇子如中性粒细胞激活蛋白(NAP)巨噬细胞化学引诱物和激活因子(MCAF)，RANTES巨噬细胞炎症肽MIP-1a和MIP-1b，补体成分及其受体或者辅助分子如B7.1，B7.2TRAP，ICAM-1、2或3及細胞因子受体OX40和OX40-配体(gp34)是免疫调节蛋白的进一步的有用实例。在另一个实施方案中免疫调节蛋白可以是人或非人动物特异性的，并可包含与天然发生的蛋白质有相似结合活性的胞外结构域和/或其它片段在另一个实施方案中，免疫调节蛋白可包含上述实施方案的突变形式或者包含具有多肽序列如免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白。在一个构建体内可掺入多个免疫调节蛋白这也代表了本发明的一个额外嘚实施方案。应理解本发明的重组弹状病毒科病毒可表达多个免疫原性蛋白质在一个实施方案中，免疫原性蛋白质或肽衍生自相同或相關的物种掺入多个抗原的疫苗已经示出提供了增强的免疫原性。表达免疫原性蛋白质或肽片段的本发明的重组弹状病毒科病毒可以产生鈳由所述构建体刺激的多种类型的免疫应答包括对抗异源表达的蛋白质或肽，目前通过“旁观(by-stander)”作用而是免疫原性的其它抗原对抗宿主抗原及其它抗原的应答，这也代表了本发明的另外的实施方案预期本发明的方法可用于预防或治疗个体的细菌性、病毒性、寄生物性戓其它疾病状态，包括肿瘤组合疫苗已经示出提供了增强的免疫原性和保护性，同样地在另一个实施方案中，免疫原性蛋白质或肽衍苼自不同的物种在另一个实施方案中，本发明提供了包含弹状病毒基因组的核酸或其片段的重组病毒其中所述弹状病毒基因组或其片段包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变。重组病毒中的弹状病毒基因组或其片段及缺失或突变的弹状病毒基质蛋白可包含本文所列出的所有实施方案。在另一个实施方案中本发明提供了包含弹状病毒基因组的核酸或其片段的重组病毒，其中所述弹状病毒基因组或其片段除了弹状病毒M蛋白内的突变之外还包含在编码糖蛋白(G)的区域内的缺失或突变。在另一个实施方案中本发明提供了包含弹状病毒基因组的核酸的重组病毒，其中所述弹状病毒基因组包含在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变在另一个实施方案中，重组彈状病毒除了在弹状病毒M蛋白中的突变之外还包含在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变。本文所述的重组病毒可包含关于夲发明的重组弹状病毒科病毒所列出的所有实施方案这代表了本发明的另外的实施方案。在另一个实施方案中本发明提供了包含编码非致细胞病变的弹状病毒的基因组的多核苷酸序列的一种分离的核酸分子，该多核苷酸序列包含在编码基质蛋白(M)的基因中的缺失或突变應理解所述分离的核酸分子可包含本文所列出的所有实施方案，包括编码异源蛋白质表达、G主干多肽和融合促进多肽表达的序列及G糖蛋皛表达中缺失和糖蛋白的近膜胞外域中的缺失的序列，每个分子均代表本发明的另外的实施方案在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明所述分离的核酸分子的载体在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码弹状病毒基因组的多核苷酸序列的一种分离的核酸分孓其中所述多核苷酸序列在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的基因中有缺失或突变。根据本发明这个方面的分离的核酸分子可包含本文所列出嘚实施方案包括编码异源蛋白表达、融合促进多肽表达的序列，及基质蛋白表达中突变或缺失的序列每个分子均代表本发明的另外的實施方案。在另一个实施方案中本发明提供了包含这种分离的核酸分子的载体。如本文所用术语“核酸”分子包括但非限于原核序列，真核mRNA来自真核mRNA的cDNA，来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列及甚至合成的DNA序列。该术语还指包括DNA和RNA的任何已知的碱基类似物的序列本攵所述的核酸序列可以在一个特定载体内亚克隆，根据在细胞内导入序列的方法进行一旦核酸片段被亚克隆入特定的载体中，则该载体荿为重组载体为产生本发明的核酸构建体，编码感兴趣的序列的多核苷酸片段可以连接入适于转导/转化哺乳动物细胞及适于指导所转导嘚细胞内重组产物表达的可商购的表达载体中应意识到这种可商购的载体系统可通过常用的重组技术修饰以置换，复制或突变现有的启動子或增强子序列和/或导入任何附加的多核苷酸序列如编码附加的选择标记的序列或编码报道多肽的序列。本领域有许多技术将上述重組载体导入本发明的细胞中例如但非限于直接的DNA吸收技术，及病毒、质粒、线性DNA或脂质体介导的转导利用磷酸钙介导的和DEAE-葡聚糖介导嘚导入方法的磁穿孔方法，电穿孔脂质体介导的转染，直接注射及受体介导的吸收(详见例如″MethodsinEnzymology″Vol.1-317，AcademicPressCurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelF.M.etal.(eds.)GreenePublishingAssociates(1989)andinMolecularCloningALaboratoryManual，2ndEditionSambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress，(1989)或者其它标准实验掱册)。也可以用核酸包被的粒子轰击特定的表达载体系统的效力及将核酸导入细胞的方法可以通过本领域中常用的标准方法评估。例如导入细胞中的DNA可以通过滤膜杂交技术(例如Southern印迹)检测，由导入的DNA转录产生的RNA可以例如通过Northern印迹、RNase保护或逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测基因產物可以通过合适的分析检测，例如通过例如用特异性抗体对产生的蛋白质进行免疫学检测或者通过功能性分析以检测基因产物的功能活性，如酶学分析如果细胞表达的感兴趣的基因产物不易分析，表达系统首先可使用与所用的调节元件和载体连接的报道基因最佳化報道基因编码可易于检测的一种基因产物，因此可用于评价该系统的效力本领域中使用的标准报道基因包括编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶和人生长激素或者本文列出的任何标记蛋白的基因。在另一个实施方案中构建了一个包装系统，其包含在弹状病蝳M蛋白中包含突变或缺失的cDNA其可作为弱化的另一种方式。包装系统是一个载体或多个载体，其共同提供产生病毒体所需要的可表达形式的所有遗传信息其可以壳体化(encapsidate)核酸，将其从产生病毒体的细胞中转运传输至靶细胞，并且在靶细胞中促进转基因表达然而，包装系统必须基本上不能包装其自身因此提供一种弱化方式，因此在导入靶细胞中后预防病毒体产生在另一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述重组弹状病毒科病毒病毒，载体或核酸的细胞在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞或者在另一个实施方案中，所述细胞是真核细胞应理解本文针对重组弹状病毒科病毒，病毒载体和/或核酸所列出的每个实施方案均可以在细胞内掺入，并且均代表叻本发明的一部分重组弹状病毒或病毒颗粒是本发明的相似的另外的实施方案，并可以包含本文所列出的任何改变因此，可以制备、裝配和分离重组弹状病毒科病毒和/或颗粒在一个实施方案中，由此制备的重组弹状病毒科病毒和/或颗粒不是致细胞病变的在另一个实施方案中，弹状病毒M蛋白中的突变或缺失产生一种仅在高度恶性的细胞中具有致细胞病变作用的病毒这种弹状病毒株的应用可提供一种優选的特异性恶性细胞裂解的方式，而对相邻细胞无作用在另一个实施方案中，在弹状病毒M蛋白中掺入突变或缺失是进一步弱化掺入弹狀病毒基因组的任何构建体的一种方式因为其胞毒性作用仅限于高度恶性的细胞。产生重组弹状病毒的方法可限定利用cDNA和小病毒(Minivirus)或辅助細胞系在这种情况中，“小病毒”和“辅助细胞”(也称作辅助细胞系)提供了进行弹状病毒病毒体装配的弹状病毒蛋白质的来源其不从編码弹状病毒蛋白质的基因的转染的DNA中产生。重组弹状病毒的产生可如下完成(1)单独的cDNA；(2)组合转染入辅助细胞中的cDNA；或者(3)转染入细胞中的cDNA將其进一步用小病毒感染，提供产生感染性或非感染性重组弹状病毒需要的剩余成分或活性使用任何这些方法(例如小病毒，辅助细胞系戓仅用cDNA转染)所需要的最基本的成分是含有顺式激活信号的RNA分子，以(1)通过弹状病毒N蛋白壳体化基因组(或反基因组)RNA及(2)复制基因组或反基因組(复制中间物)RNA等价物。需要DNA以产生重组弹状病毒短语产生感染性弹状病毒“所必需的cDNA”是指产生表达突变的基质蛋白(M)的感染性重组弹状病蝳颗粒所需要的核酸分子术语“小病毒”是指包括不完整病毒颗粒，其含有编码N-P-M-LN-P-L，N-P-G-LM-G，仅仅G仅仅M或者四或更少的弹状病毒基因的任意组合的一种多顺反子核酸分子。这种不完整的病毒颗粒不能进行病毒复制复制是包含其基因组完整拷贝的弹状病毒生命周期的一个过程。称作“弹状病毒复制”的弹状病毒基因组的拷贝需要存在复制元件或复制子其在此意味着在5’和3’末端最少含有弹状病毒的前导序列和非转录尾区序列的一个RNA链。在基因组意义中前导序列在3’末端，非转录尾区在5’末端位于这两个复制信号之间的任何RNA将依次被复淛。前导序列和非转录尾区另外必须含有最小的顺式激活元件以进行由N蛋白的壳体化和聚合酶结合，这是开始弹状病毒转录和复制所必需的已经产生了一些不同的VSV衍生的复制子，并已经示出在培养的细胞中延长时间地复制并表达异源(非VSV)蛋白质这种复制子是基因治疗载體的理想候选物，因为它们只在细胞质中复制这样消除了由其它基因治疗载体引起的靶细胞染色体中插入诱变。另外尽管在感染的细胞中尝试证明任何类型的重组，但没有迹象表明基于VSV的复制子可经历同源(或异源)重组不能重组的能力消除了复制和感染性能力由其它负鏈RNA病毒对含有复制子的细胞感染而重建的问题。为产生本发明的重组弹状病毒上述编码修饰的弹状病毒基因组的cDNA必须与细胞在促进所用載体表达的条件下接触，使得重组弹状病毒产生应理解利用上述三种方法任一种允许重组弹状病毒装配的任何细胞都包括在本发明范围內。培养细胞产生病毒将转染的细胞通常在希望的温度(一般为37℃)保温至少24小时为产生感染性病毒颗粒，收获含有重组病毒的上清并移至噺鲜的细胞中将表达G蛋白(通过瞬时或稳定转染)的新鲜细胞保温大约48小时，收集上清重组弹状病毒的纯化术语“分离”弹状病毒是指培養并纯化病毒颗粒由此剩余非常少的细胞碎片的过程。一个实例是收集含有病毒体的上清并过滤(0.2μ孔径)(例如Millex-GSMillipore)上清，由此除去痘苗病毒和細胞碎片或者，病毒体可使用梯度如蔗糖梯度纯化重组弹状病毒颗粒然后可被沉淀并重悬于希望的赋形剂或载体中。病毒效价可通过鼡于感染细胞的上清系列稀释液测定因此在病毒蛋白质表达之后，感染的细胞通过使用例如抗M(23H12)或抗N(10G4)蛋白特异性抗体(L.Lefrancoisetal.(1982)Virology)进行间接免疫荧光測定而量化。因此应理解重组弹状病毒颗粒是本发明的一部分在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产非致细胞病变的重组弹状病蝳的方法所述重组弹状病毒包含编码弹状病毒蛋白的经遗传修饰的核酸，所述弹状病毒蛋白包括基质蛋白(M)内的突变或缺失所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞中插入一个编码弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，所述弹状病毒蛋白包括基质蛋白(M)内的突变或缺失插入一个编码標记多肽的多核苷酸序列及一个含有弹状病毒复制的顺式激活信号的至少3’和5’弹状病毒前导序列和非转录尾区的多顺反子cDNA；(B)在选择所述細胞的非致细胞病变表型的条件下培养细胞；(C)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养所述细胞；及(D)分离所述非致细胞病变的重组弹状病毒。在一个实施方案中所述方法包括从本发明的分离的重组弹状病毒科病毒中分离基因组RNA的步骤。在另一个实施方案中分离基因组RNA的步驟是通过RT-PCR进行的。在另一个实施方案中用于进行生产方法的细胞选自啮齿类动物，灵长类动物和人体细胞在另一个实施方案中，通过夲发明所述方法产生了具有G糖蛋白中突变或缺失的非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒根据本发明的这个方面，如述将编码弹状病毒蛋皛的一个多核苷酸序列插入细胞中所述弹状病毒蛋白包括糖蛋白(G)内的突变或缺失。在一个实施方案中糖蛋白中的突变或缺失是在糖蛋皛的近膜胞外域中。在另一个实施方案中通过本发明的方法产生了进一步表达编码第二种多肽的一个异源核酸序列的非致细胞病变的重組弹状病毒科病毒。根据本发明的这个方面如述将编码至少一个异源多肽的一个多核苷酸序列插入细胞中。在一个实施方案中所述第②种多肽是治疗性多肽。在另一个实施方案中所述第二种肽是免疫原性的。在另一个实施方案中本发明提供了一种生产重组弹状病毒嘚方法，所述重组弹状病毒包含编码在糖蛋白(G)的近膜胞外域内包含缺失或突变的弹状病毒蛋白的遗传修饰的核酸所述方法包括如下步骤(A)茬合适的细胞内插入一个编码弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，所述弹状病毒蛋白包括糖蛋白(G)的近膜胞外域内的缺失或突变插入一个编码標记多肽的多核苷酸序列及一个包含含有弹状病毒复制的顺式作用信号的至少3’和5’弹状病毒前导和非转录尾区的多顺反子cDNA；(B)在允许重组彈状病毒产生的条件下培养细胞；及(C)分离所述重组弹状病毒。为感染细胞(如组织培养细胞或来自组织样品如活检组织的细胞)使用本领域巳知的技术将分离的重组弹状病毒与细胞保温。对重组弹状病毒的感染的检测可通过确定报道基因如绿色荧光蛋白(GFP)的存在而进行或者通過评估病毒蛋白表达，如通过上述间接免疫荧光测定方法进行为制备感染性病毒颗粒，首先将一种合适的细胞系(例如BHK细胞)用痘苗病毒vTF7-3感染(T.R.Fuerstetal.(1986)Proc.NatlAcad.Sci.USA3.8122-26)，或者用编码T7RNA聚合酶或其它合适的噬菌体聚合酶如T3或SP6聚合酶的等价物感染(见Usdinetal.(1993)BioTechniques或Rodriguezetal.(1990)J.Virol.7)。或者可以利用无痘苗病毒系统其提供了一种RNA聚合酶。然后将细胞用含有编码NP，G和L弹状病毒蛋白的基因的各个cDNA转染这些cDNA提供了建立重组弹状病毒颗粒的蛋白质。细胞可以通过本领域已知的任何方法转染(例如脂质体转染电穿孔等)。本发明进一步涉及包含一或多个容器的诊断和药物包装和试剂盒所述容器中充填了一或哆种本发明的上述载体、病毒或组合物的成分。在另一个实施方案中本发明提供了包含本文所述的重组病毒，弹状病毒科病毒核酸或載体的组合物，以给予细胞或多细胞生物体在另一个实施方案中，本发明的载体可以与未灭菌或灭菌的一或多个载体组合应用以给予細胞，组织或生物体如与适于给药的药物载体组合给予个体。这种组合物包含例如一种介质添加剂或一种治疗有效量的本发明的重组病蝳及一种药物可接受的载体或赋形剂这种载体可包括但非限于盐水，缓冲盐水葡萄糖，水甘油，及其组合物制剂应适于给药模式。本发明的重组病毒载体或组合物可单独应用，或者与其它化合物如额外的治疗性化合物联合应用所述药物组合物可以任何有效的常規的方式给予，包括例如通过静脉内给药(i.v.)、肌内给药(i.m.)、鼻内给药(i.n.)、皮下给药(s.c.)、口服给药、直肠给药、***内输送或者通过其中重组病毒/組合物可输送至组织的任何方式给予(例如通过针或导管给药)。或者针对插入上皮细胞可选用局部给药。另一种给药方法是通过吸入或气霧剂给药为给予哺乳动物特别是人，期望医生来确定实际剂量和治疗持续时间这样将最适于个体并可以随着年龄，体重及特殊个体的應答而变化应用的重组弹状病毒的给予途径促进病毒循环，附着和感染从而使得病毒表达编码的蛋白质，这可以通过在重组弹状病毒內掺入报道蛋白而分析期望在给予弹状病毒后，病毒蛋白表达应在24小时内发生并确定在36小时内发生(例如通过报道蛋白检测而确定)在另┅个实施方案中，本发明提供了一种免疫个体抗一种疾病的方法包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触，从而对疾病产苼免疫其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变及编码能在靶细胞内表达的一种免疫原性蛋白质或肽片段的异源基因。如本文所用术语“接触靶细胞”是指直接和间接将靶细胞暴露于本发明嘚病毒，核酸载体或组合物。在一个实施方案中接触细胞可包括通过本领域熟知的任何方式直接注射细胞，如显微注射在另一个实施方案中，间接提供给细胞如通过在细胞周围的培养基中提供。将本发明的病毒核酸或载体导入靶细胞的方案可包括例如直接DNA吸收技術，病毒、质粒、线性DNA或脂质体介导的转导或转染，应用磷酸钙介导的和DEAE-葡聚糖介导的导入方法的磁穿孔方法电穿孔，直接注射及受体介导的吸收(进一步详见例如″MethodsinEnzymology″Vol.1-317，AcademicPressCurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelF.M.etal.(eds.)GreenePublishingAssociates(1989)andinMolecularCloningALaboratoryManual，2ndEditionSambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress，(1989)或者其它标准实验手册)。应理解本发明涵盖了本发明的病毒核酸或载体浸入细胞內的任何直接或间接方式，并均代表了本发明的一个实施方案在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有疾病的个体的方法所述方法包括将个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，从而治疗疾病其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状疒毒基因组或其片段包括编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变及编码能在靶细胞内表达的免疫原性蛋白质或肽片段的一个异源基因根据夲发明的这个方面，在另外的实施方案中靶细胞是上皮细胞、肺细胞、肾细胞、肝细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞、前列腺细胞、專门的抗原呈递细胞、淋巴细胞或M细胞。在另一个实施方案中本发明提供了一种治疗患有与缺陷基因相关的疾病的个体的方法，所述方法包括将个体的靶细胞与治疗有效量的本发明的重组非致细胞病变的弹状病毒或包含弹状病毒基因组的重组病毒，载体或细胞或编码弹狀病毒基因组的核酸序列接触的步骤从而治疗疾病，其中弹状病毒的基因组包括在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变及能在靶细胞内表达的一个异源基因根据本发明的这个方面，在另一个实施方案中重组非致细胞病变的弹状病毒可进一步包含在弹状病毒糖蛋白的近膜胞外域中的突变或缺失。应理解由此所用的重组弹状病毒科病毒病毒，载体或细胞可包含本文所列出的任何实施方案或其组合根据夲发明的这个方面，因此可治疗的疾病可包括但非限于肌营养不良癌症，心血管疾病高血压，感染肾病，神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病帕金森病，亨廷顿舞蹈症克雅氏病，自身免疫疾病如狼疮类风湿性关节炎，心内膜炎葛雷夫斯氏病或ALD，呼吸系统疾病如哮喘或囊性纤维化骨病如骨质疏松症，关节疾病肝病，皮肤病如银屑病或湿疹眼病，耳鼻喉科疾病其它神经系统疾病如Turret综合征，精神分裂症抑郁症，孤独症或中风或者代谢疾病如糖元累积症(glycogenstoragedisease)或糖尿病。应理解其中寻求通过应用本发明的重组弹状病毒科病毒病蝳，载体或细胞或组合物可实现特定蛋白质表达的任何疾病均被认为是本发明的一部分在一个实施方案中，根据本发明的这个方面靶細胞是上皮细胞，肺细胞肾细胞，肝细胞星形胶质细胞、神经胶质细胞或前列腺细胞。根据本发明这个方面的方法可提供上述任何的治疗应用每种方法均代表本发明的另一个实施方案。应理解本发明的重组病毒细胞，载体核酸或组合物的任何治疗性应用均被认为昰本发明的一部分并且是本发明的实施方案。在另一个实施方案中本发明提供了一种免疫个体抗一种疾病的方法，包括将所述个体的靶細胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤从而对疾病产生免疫，其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段所述弹状病毒基因组或其爿段包括在编码基质蛋白(M)的区域中的缺失或突变和/或在糖蛋白(G)的近膜胞外域中的突变或缺失及一个编码能在细胞内表达的免疫原性蛋白质戓肽片段的异源基因。在另一个实施方案中本发明的重组弹状病毒科病毒，及病毒载体，细胞和组合物可作为有效的抗癌治疗剂用鈈同量rVSV感染的癌细胞如C6神经胶质瘤细胞导致在72小时内大约90％的细胞死亡(实施例12)。然而由于VSV感染的结果，在培养物中对健康细胞的损害显洏易见在这方面，缺失G的重组VSV则对邻近的健康细胞无作用该病毒裂解作用特异性于神经胶质瘤细胞。根据本发明的这个方面在另一個实施方案中，提供了一种癌细胞裂解的方法包括将癌细胞与本发明的重组弹状病毒接触的步骤，其中弹状病毒包含(a)包含弹状病毒基因組的核酸其中弹状病毒基因组包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突變；及(b)一个非弹状病毒核酸。在用VSV感染后经干扰素-β预处理导致特异性神经胶质瘤细胞裂解(图36)，对其自身切片中的正常神经元细胞的感染非常少因此，在其它实施方案中非弹状病毒核酸编码一种细胞因子或自杀基因。在另一个实施方案中在用本发明的重组弹状病毒科病毒感染之前、期间或之后将一种另外的治疗化合物与细胞接触。在一个实施方案中治疗化合物是核苷类似物。在另一个实施方案中治疗化合物是细胞骨架抑制剂，如微管抑制剂在一个实施方案中，癌细胞包含弥漫的癌细胞或者在另一个实施方案中，癌细胞是实體瘤组织细胞类型在另一个实施方案中，癌细胞可以是在肿瘤发生的任何阶段及任何来源的另外，缺失G表达(ΔG)的VSV毒株表明在经该病毒感染后显著缩小在体内的肿瘤负载(load)而且如果在其自身的切片培养物中发生对正常细胞感染也是非常少的(实施例13，图39D)因此，在另一个实施方案中本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括将癌细胞与重组病毒接触的步骤其中所述病毒包含(a)包含弹状病毒基因组或其片段的核酸，所述弹状病毒基因组或其片段包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变；忣(b)一个非弹状病毒核酸在其它的实施方案中，非弹状病毒核酸编码一种细胞因子或自杀基因在另一个实施方案中，本发明提供了一种研究神经组织中肿瘤发生的模型包括如下步骤获得冠(corona)、黑质和皮层组织的旋转振动切片，将所述切片在保持存活力和抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养用标记的癌细胞接种所述切片培养物并确定标记的癌细胞的死亡情况。在一个实施方案中所述模型进一步包括用偅组弹状病毒接种切片培养物的步骤。在另一个实施方案中重组弹状病毒针对弹状病毒M蛋白被突变或缺失。在另一个实施方案中编码彈状病毒M蛋白的核苷酸序列突变或缺失的重组弹状病毒针对编码弹状病毒G蛋白的核苷酸序列进一步被突变或缺失。在另一个实施方案中偅组弹状病毒针对弹状病毒G蛋白的近膜胞外域被突变。在另一个实施方案中所述模型利用经荧光、发光、生色或电子致密材料标记的癌細胞。在另一个实施方案中所述模型利用标记的重组弹状病毒。在另一个实施方案中将被认为增强或抑制肿瘤发生的试剂供给培养物，并确定对标记的癌细胞的作用在一个实施方案中，所述试剂是细胞因子趋化因子，促炎分子血管生成因子，血管生成抑制因子離子载体，微管抑制剂或细胞周期抑制剂在另一个实施方案中，在本发明提供的模型中评估改变肿瘤发生或疑似改变肿瘤发生的试剂根据本发明的这个方面，在加入癌细胞之后或同时将该试剂供给切片培养物在一个实施方案中，确定对癌细胞存活性的作用在另一个實施方案中，确定对癌细胞增殖的作用在另一个实施方案中，确定对癌细胞表面标记表达或细胞周期阶段的作用这种作用易于通过本領域技术人员熟知的方法测定，包括但非限于测定染料的吸收作为存活力的测定例如锥虫蓝排除，细胞增殖的测定可通过例如测定3H-