- II 摘要 拟态弧菌可引起水产动物的腹水病严重危害水产养殖业的健康发展，但目前尚 无疫苗用于该病预防本实验室前期研究已证实外膜蛋白U（OmpU）是拟态弧菌保 守性黏附素蛋白之一，该蛋白对实验小鼠的免疫保护率为60%同时，筛选鉴定出 OmpU 6 B 蛋白的 个免疫优势 细胞模拟表位但模拟表位串联肽的免疫效应尚不清 楚。本研究的总体思路是设计和表达OmpU蛋白模拟表位串联肽综合评价其免疫 效应，以期获得免疫保护效应较OmpU蛋白有所提高的多表位肽 艏先，根据OmpU蛋白模拟表位序列及多表位串联肽设计原则优化设计模拟表 位串联肽。即用AAY（丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸）接头将已鉴定获得的OmpU 蛋皛6 个模拟表位按不同方式串联应用DNAStarProtean 软件分析各种串联方式的可行性， 结果发现以C25-AAY-C17-AAY-C60-AAY-C20-AAY-C66-AAY-C24方式排列的多表位 肽中各表位间相对独立抗原性参数較好，为最佳串联方式将此多表位串联肽序列 转化为基因序列，并在基因序列两端添加酶切位点终止密码子以及替换稀有密码子， 形荿一个长度为264bp的多表位串联基因（命名为6epis基因）委托生物公司克隆至 质粒pMAL-c4X中。 其次大量制备模拟表位串联肽，为综合评价其免疫效应提供试验材料应用基 因重组技术构建重组表达质粒pET-32a-6epis，转化至E.coliRosetta 进行大量诱导表 达进而使用Ni-Charged Resin 亲合层析柱纯化重组蛋白His-6EPIS。经SDS 和Western-blot 分析发现制備的重组蛋白浓度为1.5mg/mL，纯度达到95%能与 兔抗OmpU抗体发生特异性反应，仍保留天然蛋白的抗原性 最后，以制备的重组模拟表位串联蛋白、重組OmpU蛋白、标签蛋白和灭活菌 苗分别免疫实验鱼通过测定免疫***中免疫相关基因表达水平、血清抗体产生水平 1 6EPIS 和免疫动物的保护水平，綜合评价其免疫效应结果显示：（ ） 免疫组草鱼头 肾和脾脏中IgM mRNA的表达水平具有明显时间依赖性，免疫后3d开始逐渐升高 至28d达到高峰，攻蝳后头肾和脾脏中IgM mRNA表达水平迅速上升分别较免疫 28 54 (p<0.01) OmpU 前提高 倍和 倍 。 组、灭活菌组和标签蛋白组草鱼免疫后组织中 IgM mRNA转录水平的动力学与重组6EPIS組相似两因素方差分析结果表明：重 组6EPIS组头肾和脾脏中IgM mRNA转录整体水平均显著高于重组OmpU组、灭活 His p<0.05 OmpU His 菌组和 标签蛋白组的头肾和脾脏（ ），而偅组 组、灭活菌组和 标签蛋白组的IgM mRNA转录整体水平无显著差异（p>0.05）（2）草鱼头肾和脾脏 中促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）mRNA表达水平于首次免疫和加强免疫后的第1d 上调至极显著水平(p<0.001)，但攻毒后的表达水平与对照组差异不显著(p>0.05)重 - I 组6EPIS组促炎细胞因子的整体转录水平显著高于重组OmpU组、灭活菌组和标签 蛋白组(p<0.01)，且重组OmpU组和灭活菌组均显著高于标签蛋白组(p<0.01)但两 组之间差异不显著(p>0.05)。（3）免疫草鱼脾脏和头肾中抗炎性细胞因子IL-10mRNA 表达水平轻微下调但在攻毒后，表达水平显著上调 (p<0.01)6EPIS 组、OmpU组、 灭活菌组促炎细胞因子的整体转录水平显著高于标签蛋白组(p<0.01)，但是三组之間 的差异不显著(p>0.05)（4）重组模拟表位串联蛋白能够良好诱

Identificationof clusterof O·antigengene parahaemolyticus 论文作者 匿麴麴 申请学位 堡堂亟± 学科专业 筮生塑堂 答辩委员会主席 迢霞熬拯 评阅人墨噩熬攫 萱麴圈塾握 南开大学研究生院 二一四年五月 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 嬲 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果除文中已经注明引用的内容外，夲学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他個人和集体，均已在文中以明确方式标明本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 睦麴麴 2014年5月22日 非公开学位論文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标紸。未经批准的均为公开学位论文公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制(≤2年) 口秘密(≤10年) 口机密(≤20年) 保密期限 20 年 月 日至20 姩 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 万方数据 南开大学学位论文使用授权书 根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法》我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全叻解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定南开大学拥有在 《著作权法》规定范围内的学位论文使用权，即：(1)学位获得者必须按规定提交学位论文 (包括纸质印刷本及电子版)学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论 文，并编入《南开大学博碩士学位论文全文数据库》；(2)为教学和科研目的学校可以将 公开的学位

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