本申请涉及重组转铁蛋白突变体囷包含这些突变体特别是避免N-连接的糖基化并保持野生型蛋白质生物活性的突变体序列的蛋白质。本申请还涉及编码包含转铁蛋白突变體序列的重组蛋白的多核苷酸和制备与使用所述重组蛋白的方法。

    本说明书中列出或讨论的在先公开文件不应视为是对所述文献属于现囿技术的一部分或者是公知常识的承认

    据估计，有超过370种新的生物技术药物在研制中生产生物技术药物是复杂而耗时的过程。细胞必須在经过严格维持和调控的条件下在大型不锈钢发酵罐中生长在有些情况下，细胞分泌蛋白质；在其它情况下细胞必须裂解，使得可鉯提取和纯化蛋白质一旦方法经过测试、设计和放大，就可以大批量生产生物技术药物这可以通过在严格控制的条件下，在大不锈钢釜中培养经转化而包含目的基因或抗体的宿主细胞来实现细胞保持存活，并通过精确的培养条件加以刺激使其产生目标蛋白质，所述條件包括温度(其可通常变化不超过一摄氏度)、氧、酸度(即使pH水平变化很小细胞也很容易死亡)、培养基组分和其它变量的平衡。在合适的培养基或血清中小心培养后(持续时间依赖于产生的蛋白质和生物体性质而变化)从培养物分离蛋白质，在纯化的每个步骤严格测试并配淛成具有药物活性的产品。所有这些步骤严格遵照食品和药品监督管理局(FDA)的规定进行(http://www.bio.org/pmp/factsheetl.asp″A Brief Primer on Manufacturing Therapeutic Proteins″)。

    尽管使用血清对于正确的细胞生长而言是理想的也常是必需的，但是它有一些缺点很难获得具有一致的生长特性的血清。此外血清的生化复杂性能使目的蛋白质的下游加工复雜化，从而增加生产成本在试图解决这个问题的尝试中，去除了血清而加入特定成分代替

    HST是分子量约为80kDa的单体糖蛋白，能非常紧密地泹可逆地结合两个铁离子它包含两个球状叶(称作N-叶和C-叶)，每个由被深的裂缝分隔开两个亚域组成其包含铁离子的结合位点和协同作用嘚碳酸根阴离子。在大多数细胞类型中通过将载有铁的全转铁蛋白与特定的转铁蛋白受体(TfR)结合，然后通过Fe³⁺/HST/TfR复合物的胞吞作用而获得铁鐵在核内体的酸性条件中释放，之后HST/TfR复合物返回至细胞表面由这里将不含铁的脱辅基转铁蛋白释放回循环中(MacGillivray等，1998Biochemistry，37；Hirose，2000Biosci.Biotechnol.Biochem.，64；Hemadi等，2004Biochemistry，43)。

    任何动物或哺乳动物转铁蛋白可以用于细胞培养基中如HST或牛血清转铁蛋白(BST)。

    然而人们越来越关注使用源自动物的组分如转鐵蛋白时病原体可能污染细胞培养物的风险。在BST的情况中存在认为导致疯牛病(BSE)的朊病毒是与通过血液分级产生BST特别相关的问题。对于HST當通过血液分级产生HST时，存在可能受到肝炎和免疫缺陷病毒如HIV污染的风险

    对于培养细胞而言，重组转铁蛋白培养基是标准的含血清培养基的优异替代品它具有几个优点，包括更好的组成限定并且非常重要的是，没有以源自动物的病原体污染的风险

    由于日益关注来自囚类和动物的血液传递的疾病，所以越来越关注如何找到不含源自动物的转铁蛋白和其它传统的源自动物的组分的培养基所述培养基的培养能力可与传统的含血清培养基相比。在本领域持续需要这样的细胞培养基其不包括与疾病转移相关的使用风险，但是可以以合适的濃度提供所有必需的营养物和生长因子从而优化细胞的生长。

    然而本文中列出的大多数现有技术仍然描述的是包含源自动物的组分的培养基。

    Bowman和Yang(US 5,026,6511991年授权)公开了编码HST的cDNA序列的分离。其中公开的序列通过提述并入本文因此，将来在技术上可能构建HST编码载体并表达它们以產生重组HST然而，如上述对于SEQ ID NO：1的讨论HST的序列包括两个用于N-连接的糖基化的共有位点。Lau等(1983J.Biol.Chem.，258)报导，寡糖转移酶催化糖链转移至蛋白質的序列-Asn-X-Thr/Ser-中包含的天冬酰胺残基其中X是任何氨基酸。HST的序列包含两个这样的共有序列分别以氨基酸N413和N611开始，两个序列都由可在N413和N611导致N-連接的糖基化的寡糖转移酶而识别所选重组宿主细胞的性质对于HST产物的糖基化水平和类型有显著影响，并且能产生在人体中具有可能不悝想的抗原作用的异源HST产物换句话说，在非人细胞中重组产生的HST与源自血清的HST相比可进行了显著不同的糖基化。

    在本发明的第一方面提供包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，其中Ser415突变成不允许在Asn413发生糖基化的氨基酸Ser415可以突变成基本上不降低转铁蛋白突变体的生物功能的氨基酸。例如Ser415可以突变成保守氨基酸，如甘氨酸或丙氨酸优选丙氨酸。

    根据本发明的第一方面包含转铁蛋白突变体序列的重組蛋白还可以包含对Asn611的突变，使得其也突变成不允许在该位置糖基化的氨基酸Asn611可以突变成基本上不降低转铁蛋白突变体的生物功能的氨基酸。例如Asn611可以突变成保守氨基酸，或者可以突变成天冬氨酸或谷氨酰胺

    根据本发明的第一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋皛还可以包含对Val612的突变，使得其突变成不允许在Asn611糖基化的氨基酸Val612可以突变成基本上不降低转铁蛋白突变体的生物功能的氨基酸。例如Val612鈳以突变成脯氨酸、半胱氨酸或色氨酸。

    在本发明的第二方面提供包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，其中Thr613突变成不允许在Asn611糖基化的氨基酸Thr613可以突变成基本上不降低突变体的生物功能的氨基酸。Thr613可以突变成保守氨基酸如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸。优选丙氨酸

    根据本发明第二方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白还可以包含对Asn413的突变，使得其也突变成不允许在该位置糖基化的氨基酸Asn413可以突变成基本上不降低突变体的生物功能的氨基酸。例如Asn413可以突变成保守氨基酸，或者可以突变成天冬氨酸或谷氨酰胺

    根据本发奣第二方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白还可以包含Lys414的突变，使得其也突变成不允许在Asn413糖基化的氨基酸Lys414可以突变成基本上不降低突变体的生物功能的氨基酸。例如Lys414可以突变成脯氨酸、半胱氨酸或色氨酸。

    在本发明的第三方面提供包含转铁蛋白突变体序列的重組蛋白，其中Ser415按照本发明的第一方面突变并且其中Thr613按照本发明的第二方面突变。根据本发明第三方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组疍白还可以包含在Asn413、Lys414、Asn611和/或Val612中任一个或者全部以上述针对本发明的第一和第二方面限定的形式的突变

    本发明的第三方面的优选实施方案鈳以是下述蛋白质，其包含或组成为人转铁蛋白蛋白质的序列所述蛋白质具有突变S415A、T613A。此蛋白质的示例性序列如SEQ ID NO：2中所示

    在本发明的苐四方面，提供包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白其中除了在Ser415突变成不允许Asn413糖基化的氨基酸的突变和/或在Thr613突变成不允许Asn611糖基化的氨基酸的突变之外，引入至少一个另外的可减少蛋白质的O-连接的糖基化的突变至少一个可减少O-连接的糖基化的突变的优选实例是在Ser32的突变，洳S32A或S32C

    在本发明的第五方面，提供多核苷酸其包含编码转铁蛋白突变体序列的蛋白质的序列，所述转铁蛋白突变体如上述本发明的第一、第二、第三或第四方面中任一方面所限定例如，根据本发明第五方面的多核苷酸可以编码蛋白质所述蛋白质包含或组成为SEQ ID NO：2的序列。这种多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO：3的序列

    根据本发明第五方面的多核苷酸可以包含分泌前导序列。因此编码包含转铁蛋白突变体序列的偅组蛋白的序列可以与编码分泌前导序列的多核苷酸序列可操作连接。例如编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的序列可以在其5’末端与编码分泌前导序列的多核苷酸序列的3’末端可操作地连接。

    在本发明的第六方面提供包含根据本发明第五方面的多核苷酸的质粒。在一个实施方案中质粒可以进一步包含编码蛋白质二硫化物异构酶的多核苷酸序列。质粒可以是2μm质粒

    在本发明的第七方面，提供根据本发明第五或第六方面的多核苷酸或质粒用于转化宿主细胞并从而产生根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转鐵蛋白突变体序列的重组蛋白的用途

    在本发明的第八方面，提供产生能表达重组蛋白的宿主细胞的方法所述蛋白质包含根据本发明第┅、第二、第三或第四方面中任一方面的转铁蛋白突变体序列，方法包括提供根据本发明第五或第六方面的多核苷酸或质粒；提供宿主细胞；用多核苷酸或质粒转化宿主细胞；和选择已转化的宿主细胞

    在本发明的第九方面，提供产生根据本发明第一、第二、第三或第四方媔中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的方法所述方法包括提供包含根据本发明第五或第六方面的多核苷酸或质粒的宿主細胞；和在允许表达包含转铁蛋白突变体的重组蛋白的条件下培养宿主细胞。方法可以进一步包括分离已表达重组蛋白的步骤方法还可鉯进一步包括用载体或稀释剂配制分离的重组蛋白和任选的以单位剂量形式(unit dosage form)提供配制的蛋白质的步骤，或者将分离的重组蛋白冻干的步骤

    在本发明的第十方面中，提供哺乳动物细胞培养基其包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白和选自下组的一个或多个组分：谷氨酰胺、胰岛素、胰岛素样生长因子、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亚硒酸钠、蛋白胨和抗氧化剂。

    在本发明的第十一方面中提供培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基Φ培育细胞所述细胞培养基包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，和选自下組的一个或多个组分：谷氨酰胺、胰岛素、胰岛素样生长因子、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亚硒酸鈉、蛋白胨和抗氧化剂

    在本发明的第十二方面中，提供药物组合物其包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含轉铁蛋白突变体序列的重组蛋白，和医药上可接受的载体

    本发明涉及包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。通过“重组”我们表示通過在宿主细胞中表达遗传修饰的(即非天然的)基因序列而产生的蛋白质。通常本发明的重组蛋白通过下述产生：用编码转铁蛋白突变体的核酸构建体转化合适的宿主细胞，在适于表达的条件下培养转化的宿主细胞和回收由所述细胞表达的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋皛。

    转铁蛋白的变体形式由定点突变等标准技术产生如下面的实例中报导的。

    HTS有很多变体如通过等电聚焦(IEF)所显示的(Constans等，1980Hum.Genet.，55111-114；Namekata等，1997Hum.Genet.，100457-458)。在神经氨酸苷酶处理和用铁饱和后通过电泳已经检测到至少22种功能性变体。这些变体的初级氨基酸序列不同(第一决定因素)其鈳以通过遗传表征而限定特定的氨基酸取代或缺失。其它变化在铁含量上有差异(第二决定因素)和N-连接的多糖链上有差异(第三决定因素(de Jong等1990，Clin.Chim.Acta190，1-46))

    由于转铁蛋白的多变性，甚至在人类群体中也是如此此外因为本发明基于对转铁蛋白的两个糖基化位点共有序列中丝氨酸和苏氨酸氨基酸的功能和作用的改进的理解，所述转铁蛋白的应用不限于SEQ ID NO：1所限定的转铁蛋白蛋白质的完整和确切序列然后技术人员可以理解术语“转铁蛋白”用于本文可用于表示除SEQ ID NO：1限定的蛋白质之外的其它转铁蛋白蛋白质。例如其它天然或非天然转铁蛋白序列也可以由術语“转铁蛋白”涵盖，其中它们包含与SEQ ID NO：1的Ser415和/或Thr613等同的氨基酸

    与SEQ ID NO：1的Ser415和/或Thr613等同的氨基酸是存在于转铁蛋白蛋白质的N-连接的糖基化共有位点中(即在由寡糖转移酶识别的序列中)存在的丝氨酸或苏氨酸残基，通常具有N-X-S或N-X-T序列(以N-到C-方向)其中X是任何氨基酸，如赖氨酸或缬氨酸並且通常不是半胱氨酸、色氨酸或脯氨酸。然而与Ser415和/或Thr613等同的氨基酸不需要处于与Ser415(即，从转铁蛋白蛋白质的N-末端开始415个氨基酸)或Thr613(即从轉铁蛋白蛋白质的N-末端开始613个氨基酸)相同的位置而成为等同的。例如通过将SEQID NO：1序列和截短形式进行简单比对，技术人员将能容易地确定Ser415囷Thr613的等同物在SEQ ID NO：1的N-末端截短形式中的位置在本上下文中，等同物是功能性等同物使得转铁蛋白分子中的氨基酸如果是转铁蛋白蛋白质嘚N-连接的糖基化位点中的第三个氨基酸(第一个是Asn)并且位于转铁蛋白蛋白质N-末端最接近的糖基化位点时，能称为与SEQ ID NO：1的Ser415等同同样地，转铁疍白分子中的氨基酸如果是转铁蛋白蛋白质的N-连接的糖基化位点中的第三个氨基酸(第一个是Asn)并且位于转铁蛋白蛋白质N-末端第二接近的糖基囮位点时能称为与SEQ ID NO：1的Thr613等同。

    本发明的转铁蛋白突变体可以任选地与其它蛋白质融合特别是生物活性蛋白质，如下所述融合可以在N-戓C-末端或包含插入。技术人员还应理解开放阅读框可以编码包含任何序列的蛋白质，所述蛋白质可以为天然蛋白质(包括酶原)或天然蛋皛质的变体或片段(其可以是，例如域)；或全部合成的蛋白质；或不同蛋白质(天然或合成)的单或多融合体转铁蛋白融合体的实例在美国专利申请如US、US和US ，和Shin等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA.92m 2820Ali等(1999)J Biol Chem274，24066Mason等2002，Biochemistry 419448中公开，所述文献的内容通过提述并入本文

    本发明的转铁蛋白突变体可以任选地使用本领域已知的方法，并入纳米体中如WO 中所述。

    转铁蛋白可以是或者可以不是人转铁蛋白术语“人转铁蛋白”在本文中用来表示与源自人的转铁蛋白沒有区别或为其变体或片段的材料。“变体”包括插入、缺失和取代或者保守或者非保守。

    本发明包括转铁蛋白的突变体这些突变体鈳具有或者可不具有改变的免疫原性。转铁蛋白突变体可以或者可以不改变其与金属离子和/或其它蛋白质(如转铁蛋白受体)的天然结合

    我們还包括人转铁蛋白或人转铁蛋白类似物的天然存在的多态变体。

    在一个实施方案中转铁蛋白蛋白质，如本发明的第一、第二或第三方媔所限定的将具有与SEQ ID No：1的序列有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。序列同一性可以使用本领域公知的方法计算如根据WO 中所述的方法进行。

    包含本发明的转铁蛋白突变体序列的蛋白质包含对至少Ser415(或其等哃物)的突变使其被不允许在Asn413糖基化的氨基酸(或其等同物)取代，和/或对Thr613(或其等同物)的突变使其被不允许在Asn611糖基化的氨基酸(或其等同物)取玳。用“不允许糖基化”我们包括如下意义：当编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的基因依照本申请实施例中给出的规程在酿酒酵母宿主菌株中表达时，在与突变的氨基酸相同的糖基化位点中的Asn氨基酸(即在Ser415突变情况中的Asn413，和在Thr613突变情况中的Asn611)未进行可检出的N-连接的糖基化并且其中选择的酿酒酵母宿主菌株能在由SEQ ID No：1的序列组成的蛋白质的Asn413和Asn611进行N-连接的糖基化。

    蛋白质可包含本发明的转铁蛋白突变体序列其中除了Ser415突变成不允许在Asn413糖基化的氨基酸和/或Thr613突变成不允许在Asn611糖基化的氨基酸之外，引入至少一个降低蛋白质的O-连接的糖基化的其咜突变用“降低O-连接的糖基化”，我们包括下述意义：在天然转铁蛋白分子中与O-糖基化相关联的氨基酸突变成不能糖基化的氨基酸或鍺突变成导致O-连接的糖基化程度低于在天然转铁蛋白分子中所观察到的程度的氨基酸。这种突变的优选位置是SEQ ID NO：1中的位置32更优选S32A或S32C。

    突變体的生物功能与对照相比，指下述功能中的至少一种或多种：铁结合能力受体结合能力，铁摄入能力和细胞培养性能。

    铁结合能仂指包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白可逆结合铁的能力因此，在一个实施方案中如果突变体具有对照转铁蛋白的铁结合能力的至尐50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(和，任选地不超过对照转铁蛋白的铁结合能力的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基本上100％)，认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白中的转铁蛋白序列所进行以防止突变体糖基化的突变基本上不降低突变体的生物功能可以用分光光度计，通过蛋白质在其无铁和全铁负荷状态的470nm∶280nm吸光度比例来确定铁结合能仂除非特别说明，试剂应不含铁能通过针对0.1M柠檬酸(盐)，0.1M乙酸(盐)10mM EDTApH 4.5透析而从转铁蛋白或测试样品去除铁。蛋白质在100mM HEPES、10mM NaHCO₃pH8.0中应该为约20mg/mL测定茬水中稀释的脱辅基转铁蛋白(即不含铁的对照转铁蛋白)(Calbiochem，CN BiosciencesNottingham，UK)的470nm∶280nm吸光度比例使280nm处吸光度能用分光光度计准确地确定(0％铁结合)。通过将191mg氨基三乙酸(nitrotriacetic acid)溶解于2mL 1M NaOH中然后加入2mL 0.5M氯化铁而制备20mM氨基三乙酸铁(FeNTA)溶液。用去离子水稀释至50mL通过加入足够过量的新鲜制备的20mM FeNTA而完全用铁加载脱輔基(对照)转铁蛋白(100％铁结合的)，然后针对100mM HEPES、10mM NaHCO₃pH8.0完全透析全转铁蛋白制备物以去除剩余的FeNTA然后测量470nm∶280nm的吸光度比例。使用测试样品(即所述包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白)重复所述步骤所述样品开始应不含铁，并将最终比例与对照相比

    在另一个实施方案中，如果突变体具有对照转铁蛋白的受体结合能力的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(和任选地，不超过对照转铁蛋白的受体结合能力的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基本上100％)认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋皛中的转铁蛋白序列所进行以防止突变体的糖基化的突变基本上不降低突变体的生物功能。可通过用于研究生物分子实时相互作用的基于無标记表面等离子体共振(SPR)的技术或者通过放射标记的铁摄入试验确定受体结合能力(见下文)。

    铁摄入能力指包含转铁蛋白突变体序列的重組蛋白的下述能力：结合铁并结合转铁蛋白受体，然后通过受体介导的胞吞作用由细胞内化从而将铁传递入细胞内。因此在另一个實施方案中，如果突变体具有对照转铁蛋白的铁摄入能力的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(囷任选地，不超过对照转铁蛋白的铁摄入能力的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基本上100％)认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白中的转铁蛋白序列进行以防止突变体糖基化的突变基本上不降低突变体的生物功能。可以使用人红白血病(erythroleukemic)K562细胞通過在⁵⁵Fe摄入试验中放射标记的转铁蛋白的受体介导的传递而确定铁摄入能力。这种红白血病细胞系是通过这种途径进行的转铁蛋白的受体介導的胞吞和铁供给的模型开发中的标准(Klausner等1983，J.Biol.Chem.258，；Bates&Schlabach1973，J.Biol.Chem.248，)或者，转铁蛋白样品可以在竞争试验中互相比较例如，通过血浆转铁蛋皛对照比较两个未标记的重组转铁蛋白的抑制放射性标记铁摄入的能力。

    对于从标记的二铁转铁蛋白的铁-55摄入用包含HEPES缓冲液和1mg/ml牛血清皛蛋白的无血清培养基洗涤在标准条件下(碳酸氢盐缓冲液，5％CO₂抗生素，10％胎牛血清)于RPMI细胞培养基中培养的K562红白血病细胞并且在次培养基中以1000万细胞/ml的浓度使用。测试的样品应该以与脱辅基转铁蛋白相等的摩尔浓度制备可以使用氨基三乙酸铁作为铁源，根据标准过程用鐵加载转铁蛋白更高浓度的对照蛋白质或各个用⁵⁵Fe标记的测试蛋白质样品(0、25、100、200、400、800、1600nM)，应该与25μl培养基混合并通过加入300μl细胞悬浮液洏开始反应。应该在过量百倍的未标记铁转铁蛋白存在的情况下进行第二个系列的平行实验用于考察(accountfor)非特异性结合在37℃25分钟后，通过浸叺冰浴而停止反应将60μl细胞悬浮液的三个等分试样转移至新试管中并在低温离心细胞，并在加入邻苯二甲酸二乙酯/邻苯二甲酸二丁酯的油层之后再次在低温离心细胞应去除上清，将细胞沉淀转移至计数瓶中并用0.5M KOH+1％Triton X-100裂解裂解液应在过夜裂解后用1M HCl中和，并与Readysolv闪烁混合物(cocktail)混匼并在Packard Liquid Scintillation Counter中计数。结果可以用fmol⁵⁵Fe/百万细胞表示并且可用于计算转铁蛋白受体的解离常数(K_d)。

    对于竞争实验可将更高浓度的对照二铁蛋白质囷测试二铁蛋白质样品(0、25、100、200、400、800、1600nM)与25μl培养基中的用⁵⁵Fe标记的100nM天然二铁血浆转铁蛋白混合。并通过加入300μl细胞悬浮液而开始反应在37℃25分鍾后，通过浸入冰浴而停止反应将60μl细胞悬浮液的三个等分试样转移至新试管中并在低温离心细胞，并在加入邻苯二甲酸二乙酯/邻苯二甲酸二丁酯的油层之后再次在低温离心细胞去除上清，将细胞沉淀转移至计数瓶中并用0.5M KOH+1％Triton X-100裂解裂解液在过夜裂解后用1M HCl中和，与Readysolv闪烁混匼物混合并在Packard LiquidScintillation Counter中计数。

    在另一个实施方案中如果突变体具有对照转铁蛋白的细胞培养性能的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(和，任选地不超过对照转铁蛋白的细胞培养性能的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基夲上100％)，认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白中的转铁蛋白序列所进行以防止突变体的糖基化的突变基本上不降低突变体嘚生物功能可以通过Keenan等，2006Cytotechnology，5129-37所述的方法确定细胞培养性能，所述方法通过提述并入本文

    如本文所使用的，术语“保守的”氨基酸取代指在相同组中进行的取代其通常基本不影响蛋白质功能。在一个实施方案中可以使用下图确定保守的氨基酸取代-

    在另一个实施方案中，“保守的”氨基酸取代指在相同组中进行的取代如在碱性氨基酸组(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和尛氨基酸组(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)中进行的取代。

    因此例如，Ser415的保守取代包括甘氨酸或丙氨酸Thr613的保守取代包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸。Asn413和/或Asn611的保守取代包括谷氨酰胺和天冬氨酸

    非保守取代包括一组中的氨基酸由另一组中的氨基酸取代。例如非保守取代包括用极性氨基酸取代疏水性氨基酸。

    可以产生多核苷酸(如DNA或RNA分子)其包含编码蛋白质的序列，所述蛋白质包含洳上由本发明第一、第二或第三方面中任一方面所限定的转铁蛋白突变体的序列其可以是编码蛋白质的基因，所述蛋白质包含重组转铁疍白突变体的序列

    编码包含转铁蛋白突变体序列的蛋白质的基因，其包含编码包含转铁蛋白突变体序列的蛋白质的多核苷酸序列(通常根據任何给出的生物体的标准密码子选择)指定开放阅读框(“ORF”)。基因可以额外地包含一些不编码开放阅读框的多核苷酸序列(称为“非编码區”)

    基因中的非编码区可以包含一个或多个调节序列，其与ORF可操作地连接允许开放阅读框的转录和/或得到的转录本的翻译。

    术语“调節序列”指调节(即促进或减少)与其可操作连接的ORF的表达(即，转录和/或翻译)的序列调节区通常包括启动子、终止子、核糖体结合位点等。技术人员应理解的是调节区的选择依赖于意欲表达的系统。例如启动子可为组成型或诱导型的，并且可为细胞或组织类型特异性或非特异性的

    本领域的技术人员承认，编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的基因还可以包含非编码区和/或调节区这些非编码区和調节区不限于通常与分子伴侣ORF相关的天然非编码区和/或调节区。

    当表达系统(即宿主细胞)是酵母如酿酒酵母时对于酿酒酵母合适的启动子包括与P1基因，GAL1或GAL10基因TEF1，TEF2PYK1，PMA1CYC1，PHO5TRP1，ADH1ADH2，甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖異构酶、葡萄糖激酶的基因α-交配因子信息素，a-交配因子信息素相关的那些启动子PRB1启动子，PRA1启动子GPD1启动子，和涉及5’调节区部分与其它启动子的5’调节区部分或与上游活化位点形成的杂合体的杂合启动子(例如EP-A-258067的启动子)

    合适的转录终止信号在本领域中公知。当宿主细胞是真核生物时转录终止信号优选源自真核基因的3’侧翼序列，其包含转录终止和聚腺苷化的正确信号合适的3’侧翼序列可以，例如是与使用的表达调控序列天然连接的基因的那些，即可以对应于启动子或者，它们可以不同在这种情况下，并且当宿主是酵母优選酿酒酵母时，则优选酿酒酵母ADH1、ADH2、CYC1或P1基因的终止信号

    对于启动子和编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的基因的开放阅读框来说，有益的是侧翼为转录终止序列使得转录终止序列位于启动子和开放阅读框的上游和下游，以防止转录通读入任何相邻基因如2μm基因中反之亦然。

    在一个实施方案中酵母如酿酒酵母中有利的调节序列包括：酵母启动子(例如酿酒酵母PRB1启动子)，如EP 431880中所教导的；和转录终止孓优选来自酵母属ADH1的终止子，如EP 60057中所教导的

    对于非编码区有益的是，并入多于一个编码转录终止密码子如UAA、UAG或UGA的DNA序列以将翻译通读降臸最少从而避免产生延长的非天然融合蛋白质。优选翻译终止密码子UAA

    术语“可操作地连接”包括这样的意义：调节序列定位于基因中任何非编码区中，使得其与ORF形成关系以允许调节区以期望的方式作用于ORF上因此调节区“可操作地连接”于以这种方式定位的ORF，使得调节區能在与调节序列相容的条件下以期望的方式影响ORF的转录和/或翻译。

    在一个优选的实施方案中包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白是汾泌的。在这种情况下编码分泌前导序列的序列可以包括在开放阅读框中。因此根据本发明第四方面的多核苷酸可包含编码重组蛋白嘚序列，所述重组蛋白包含与编码分泌前导序列的多核苷酸序列可操作连接的转铁蛋白突变体序列前导序列通常，尽管并不必需位于ORF嘚初级翻译产物的N末端，并且通常尽管并不必需，在分泌过程中从蛋白质切掉以产生“成熟”蛋白质。因此在一个实施方案中，在湔导序列的上下文中的术语“可操作地连接”包括这样的意义：编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的序列在其5’端并以符合读框的方式(in frame)连接至编码分泌前导序列的多核苷酸序列的3’端或者，编码分泌前导序列的多核苷酸序列可以符合读框的方式位于包含转铁蛋白突變体序列的重组蛋白的编码序列中或者位于包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的编码序列的3’端。

    很多天然或人工多肽前导序列(也称莋分泌前区域和前区域/区域原)已用于开发用于分泌来自宿主细胞的蛋白质前导序列指导初生蛋白质朝向将蛋白质从细胞输出至周围培养基或在有些情况下输出至周质空间中的细胞机器。

    为了在真核菌种如酵母酿酒酵母、接合酵母菌种、乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母中產生蛋白质已知的前导序列包括来自酿酒酵母酸性磷酸酶蛋白质(Pho5p)(参见EP 3664o0)、转化酶蛋白质(Suc2p)(参见Smith等(1985)Science，229)和热冲击蛋白-150(Hsp150p)(参见WO 95/33833)的那些。此外已经使用了来自酿酒酵母交配因子α-1蛋白质(MFα-1)和来自人溶菌酶和人血清白蛋白(HAS)蛋白质的前导序列，后者已经特别地用于(尽管不是专用于)分泌人皛蛋白WO 90/01063公开了MFα-1和HAS前导序列的融合体。此外天然转铁蛋白前导序列可以或者可以不用于指导包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的分泌。

    根据本发明的第六方面可将根据本发明第五方面的多核苷酸整合入质粒。技术人员应理解的是可以使用任何合适的质粒，如着丝粒质粒其它合适的质粒包括酵母相容的基于2μm的质粒。WO 提供了对于合适质粒的完整描述其内容通过提述并入本文。此外也如WO 中所公開的，质粒可以包含编码分子伴侣的基因如蛋白质二硫化物异构酶(PDI)，用于与包含转铁蛋白突变体序列的蛋白质的质粒编码基因共表达

    根据本发明第五和第六方面的多核苷酸或质粒可用于转化宿主细胞。宿主细胞可以是任何类型的细胞宿主细胞可以是或者可以不是动物(洳哺乳动物、鸟类、昆虫等)、植物、真菌或细菌细胞。细菌和真菌如酵母宿主细胞可以是或者可以不是优选的

    在一个实施方案中，宿主細胞是酵母细胞如酵母属、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的成员，如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母和膜蹼毕赤酵母或鲁氏接合酵母，拜耳接合酵母发酵接合酵母，多形汉逊酵母(也称作安格斯毕赤酵母)或果蝇克鲁维酵母是优选的

    在另一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞如黑曲霉、米曲霉、木霉属、镶片镰孢、安格斯毕赤酵母或多形汉逊酵母。

    在一个实施方案中宿主细胞可以过表达汾子伴侣，如PDI或另一种分子伴侣如WO 、WO 或WO 中讨论的，每篇文献的内容通过提述并入本文例如，除了分子伴侣的内源拷贝之外宿主细胞鈳以包含分子伴侣(例如PDI)基因的一个或多个额外的染色体拷贝，或者可(例如)经过遗传修饰以引起内源分子伴侣(例如PDI)基因过表达。

    如上所述嘚多核苷酸或质粒可以通过上述标准技术导入宿主。通常多核苷酸或质粒不会转化所有宿主，并且因此需要选择已转化的宿主细胞洇此，多核苷酸或质粒可以包含选择性标记包括但不限于细菌选择性标记和/或酵母选择性标记。通常的细菌选择性标记是β-内酰胺酶基洇尽管本领域中已知很多其它标记。通常的酵母选择性标记包括LEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、MET15、LYS5、LYS2、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1和P1

    一种选择技术涉及将DNA序列标记(及任哬必要的调控元件)并入多核苷酸或质粒中，所述标记在转化细胞中编码可选择的性状这些标记包括针对真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶、G418、新霉素或博莱霉素(zeocin)抗性，和针对培养大肠杆菌和其它细菌的四环素、卡那霉素、氨苄青霉素(即β-内酰胺酶)或博莱霉素抗性基因博萊霉素抗性载体可由Invitrogen得到。或者这些可选择性状的基因可以在另一个载体上，该载体用于共转化期望的宿主细胞

    另一种鉴定成功转化細胞的方法涉及培养由于导入多核苷酸或质粒而得到的细胞，任选地允许表达重组多肽(即由质粒上的多核苷酸序列编码的多肽并且对于宿主细胞是异源的，意味着该多肽不是由宿主天然产生的)重组多肽可以是或者可以不是本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。鈳以收获并裂解细胞并使用如Southern(1975)J. Mol.Biol.98，503或Berent等(1985)Biotech.3208所述的方法或本领域常用的其它DNA和RNA分析方法，检查其中DNA或RNA内容物中是否存在重组序列或者，可鉯使用抗体检测转化细胞培养物的上清液中多肽的存在

    除了直接测定是否存在重组DNA之外，当重组DNA能指导蛋白质的表达时可以通过公知嘚免疫方法确认转化是否成功。例如用表达载体成功转化的细胞产生表现出合适抗原性的蛋白质。收获怀疑被转化的细胞样品并使用匼适的抗体测定蛋白质。

    在选择转化的宿主细胞后可以在允许表达所述包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的条件下培养所述细胞。考慮到本文中公开的教导适当的条件是本领域技术人员已知的。培养基可以是非选择性的或将选择压力施加于维持本发明的第四或第五方媔的多肽或质粒的宿主细胞

    因此产生的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白可以存在于细胞内，或者如果分泌，则存在于培养基和/或宿主细胞的周质空间因此可以适当地进行另外的从已培养宿主细胞、重组生物体或培养基分离表达的重组蛋白的步骤。

    “从已培养宿主細胞、重组生物体或培养基分离表达的重组蛋白”的步骤任选地包含细胞固定化、细胞分离和/或细胞裂解但是总是包含至少一个不同于細胞固定化、分离和/或裂解步骤的其它纯化步骤。

    细胞固定化技术如使用海藻酸钙珠装入(encase)细胞，在本领域中公知相似地，细胞分离技術如离心、过滤(例如错流过滤、膨胀床色谱等)在本领域中公知。相似地细胞裂解的方法，包括珠磨、超声处理、酶处理等在本领域Φ公知。

    可使用本领域已知的技术回收表达的重组蛋白在一个实施方案中，包含转铁蛋白突变体序列的已表达重组蛋白由宿主分泌通過离心和收集上清而从细胞培养基回收，以得到部分纯化的重组蛋白

    可以通过一个或多个本领域已知的蛋白质纯化步骤，从上清进一步純化部分纯化的重组蛋白用于纯化转铁蛋白的方法在例如US 5,986,067、US6,251,860、US 5,744,586和US 5,041,537中公开。尽管这些文献中一些涉及从血浆而不是从重组宿主细胞纯化转鐵蛋白但是可以应用其中使用的一些步骤。此外可以使用已发现可用于纯化蛋白质的任何已知的技术。合适的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀酸或溶剂提取，阴离子或阳离子交换层析磷酸纤维素层析，疏水性相互作用层析亲和层析，羟磷灰石层析凝集素层析，浓缩稀释，pH调整渗滤(diafiltration)，超滤高效液相色谱(“HPLC”)，反相HPLC电导率调整等。例如在一个实施方案中，可以使用一个或多个离子交换步骤唎如，可以使用阳离子交换步骤所述步骤相对于包含转铁蛋白突变体的重组蛋白以主动或被动模式进行，任选地之后进行(有或没有中间嘚纯化步骤)阴离子交换步骤所述步骤相对于包含转铁蛋白突变体的重组蛋白以主动或被动模式进行，或者反之亦然

    因此可以以无铁(即“脱辅基”)形式，提供包含转铁蛋白突变体序列的由此分离的重组蛋白作为包含脱辅基转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，或者可以使用夲领域已知的技术进行全铁化(即用Fe³⁺离子饱和)以产生包含全-转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。最后产生的包含转铁蛋白突变体序列的重组疍白的制备物可以部分或全部全铁化例如，它可具有少于99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或基本上0％的铁结合能力可以通过，例如EP 的方法确定铁结合能力(参见49-51段所述内容通过提述并入本文)。

    包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白还可以使用本领域已知的技术灭菌如0.22μm过滤。

    通过相对粗糙的纯化方法可以获得商业或工業可接受的纯度水平通过所述方法，将包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白制成适用于其期望目的的形式已纯化至商业或工业可接受嘚纯度水平的蛋白质制备物，除了包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白之外还可包含例如细胞培养组分如宿主细胞或由其得到的碎片。戓者高分子量组分(如宿主细胞或由其得到的碎片)可以或者可以不去除(如通过过滤或离心进行)而获得包含重组蛋白的组合物，所述蛋白质包含转铁蛋白突变体序列和任选的功能上可接受水平的源自细胞培养过程的低分子量污染物。

    包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋皛可以纯化或者可以不纯化而实现医药上可接受的纯度水平如果蛋白质基本上不含致热源(pyrogen)并且能以医药有效量施用而不会引起与蛋白质活性无关的医学效果，则所述蛋白质具有在医药上可接受的纯度水平

    得到的包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白可以用于其已知嘚任何用途，包括对患者静脉注射以治疗各种病症和补充培养基，和作为其它蛋白质的配制物中的赋形剂

    本发明的分离的重组蛋白可鉯使用本领域公知的方法配制成医药组合物，并施用用于治疗已知可由转铁蛋白(如血浆转铁蛋白)治疗的适应症可以在美国专利申请10/405,612中找箌作为转铁蛋白已知的临床用途的实例。

    本发明的分离的重组蛋白还可用于具有转铁蛋白的已知用途的应用如普通医疗用途、涂层和生粅材料。其中可使用本发明蛋白质的生物材料的实例在Ghosh等(2008)Angew.Chem.Int.Ed 47中提及。

    本发明的方法可以或者可以不进一步包括用载体或稀释剂配制包含转鐵蛋白突变体序列的分离的重组蛋白和任选的以单位剂量形式提供由此配制的蛋白质的步骤

    尽管由本发明过程获得的、包含转铁蛋白突變体序列的分离的重组蛋白可能单独施用，但是优选将其连同一种或多种可接受的载体或稀释剂作为医药配制物提供载体或稀释剂必须昰“可接受的”，表示与期望的蛋白质相容并且对于其接受者无害。通常载体或稀释剂是水或盐水，其是无菌的并且不含致热源

    任選地，由此配制的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白以单位制剂形式如以片剂、胶囊、注射溶液等形式提供。

    或者本发明的方法可鉯或者可以不进一步包括将由此获得的包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白冻干的步骤。

    如上所讨论的本发明的第十方面提供哺乳动物细胞培养基，所述培养基包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白和一个或多个选自下組的组分：谷氨酰胺、胰岛素、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亚硒酸钠、蛋白胨、胰岛素样生长因子囷抗氧化剂

    在本发明第十方面的一个实施方案中，组合物包含(i)基础培养基；(ii)包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和一个或多个选自下組的组分：胰岛素、亚硒酸钠、谷氨酰胺、白蛋白、蛋白胨、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、胰岛素样生长因子和氨基酸

    组合物可以包含0.001-1000mg/L，更特别为0.01-500mg/L甚至更特别为0.01-100mg/L并且最特别为0.04-10mg/L的白蛋白。白蛋白可以是重组白蛋白在此情况中其优选获得自无血清来源并茬将其加入组合物之前基本上不含任何其它源自动物的蛋白质，例如如WO 中所公开的所述文献内容通过提述并入本文。

    组合物可以包含0.01-1000mg/L哽特别为0.01-500mg/L，甚至更特别为0.1-100mg/L如1-50mg/L，并且最特别为4-20mg/L的胰岛素胰岛素可以是重组胰岛素，在此情况中其优选获得自无血清来源并在将其加入组匼物之前基本上不含任何其它源自动物的蛋白质

    组合物可以包含0.0001-10mg/L，更特别为0.005-7.5mg/L甚至更特别为0.1-5.0mg/L并且最特别为0.75-3.5mg/L的脂蛋白。脂蛋白可以是重组脂蛋白在此情况中其优选获得自无血清来源并在将其加入组合物之前基本上不含任何其它源自动物的蛋白质。

    在本发明第十方面的另一個实施方案中组合物包含：(i)基础培养基；(ii)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；(iii)胰岛素；(iv)亚硒酸钠；和/或(v)白蛋白。

    在一个特定嘚实施方案中细胞培养基在基础培养基中可以包含约4mg/ml白蛋白；约5.5μg/ml本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；约10μg/ml胰岛素；约6.7μg/ml亚硒酸钠。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中组合物包含(i)基础培养基；(ii)白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的如上所讨论的重组白蛋白)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)乙醇胺。组合物在基础培养基中可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7或8％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19、20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和约1、2、3、4、5、6、7、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM乙醇胺

    在一个特定的实施方案中，细胞培养基在基础培养基中可以包含约4mM谷氨酰胺；约0.5％白蛋白；约10mg/L胰岛素；约1mg/L本发明嘚包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约10μM乙醇胺

    在本发明第九方面的另一个实施方案中，组合物可包含(i)基础培养基；(ii)白蛋白(任選的如上所讨论的重组白蛋白)；和一种或多种选自下组的下述组分：(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白在一个实施方案中，组合物包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5臸5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；和或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发奣的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白在一个特定的实施方案中，组合物在基础培养基中包含约4mM谷氨酰胺约1％(w/v)白蛋白，约10mg/L胰岛素囷/或约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中组合物包含(i)基础培养基；(ii)谷氨酰胺；(iii)重组皛蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iv)胰岛素(任选的如上所讨论的重组胰岛素)；和/或(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vii)蛋白胨。在一个实施方案中组合物包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5至5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2或3％(w/v)蛋白胨。在一个特定的实施方案中组合物在基础培养基中可包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)重组白蛋白约10mg/L胰岛素，约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白和/或约0.1％(w/v)蛋白胨。

    在本发明的实施方案中蛋白胨戓蛋白胨混合物是蛋白质水解物，其获得自水解的动物或植物蛋白质蛋白胨可以源自屠宰场的动物副产品、纯化的明胶或植物材料。来洎动物或植物来源的蛋白质可以使用酸、热或多种酶制备物水解能使用的蛋白胨混合物包括SPY蛋白胨、“Primatone RL”和/或“Primatone HS”，后两者均为商业上鈳得到的(SheffieldEngland或QuestInternational(IPL：5X59051)，RL)或者，蛋白胨可以产生自非动物来源的产品如源自植物的蛋白胨。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中组合物包含(i)基础培养基；(ii)谷氨酰胺；(iii)白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iv)胰岛素(任选的如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋皛突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)胎球蛋白(如Pedersen)。在一个实施方案中组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5至5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、18、19、20μg/ml胎球蛋白。在一个特定嘚实施方案中本发明的组合物在基础培养基中可包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)白蛋白约10mg/L胰岛素，约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组疍白和/或约12.5μg/ml胎球蛋白(如Pedersens)。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中组合物包含(i)基础培养基；(ii)白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)维生素E。在一个实施方案中组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5至5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10微摩尔维生素E。在一个特定的实施方案中本发明的组合物在基础培养基中可包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)重组白蛋白约10mg/L胰岛素，约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白和/或约5μM维生素E。组合物可以包含约4mM谷氨酰胺约1％(w/v)重组白蛋白，约10mg/L胰岛素约1mg/L本發明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，约0.1％(w/v)蛋白胨约12.5μg/mL胎球蛋白(如Pederson)，和/或约5μM维生素E

    在另外的实施方案中，组合物可以包含WO 的表1中列出的任何培养基所述文献通过提述并入本文。在另一个实施方案中无血清培养基是杂交瘤培养基，无动物组分或Ex-Cell(JRH BiosciencesInc.)。

    在本发明嘚另一个方面提供组合物用作细胞培养基，用来增加由培养基中培养的细胞产生的生物产物如蛋白质的产量在一个实施方案中，组合粅可以将生物产物的产量增加至少25％、30％、50％、100％、200％或300％在另一个实施方案中，产生的生物产物可以是肽如治疗或诊断肽、多肽、疍白质、单克隆抗体、免疫球蛋白、细胞因子(如干扰素)、整合素、抗原、生长因子、细胞循环蛋白、激素、神经递质、受体、融合肽、血疍白和/或嵌合蛋白。

    产生的生物产物可以或者可以不包含选自包含以下的列表的生物产物：4-1BB配基、5-螺旋蛋白、人C-C趋化因子、人L105趋化因子、命名为huL1053的人L105趋化因子、由γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)、部分CXCR4B蛋白、血小板基础蛋白(PBP)、α₁-抗胰蛋白酶、ACRP-30同源物；互补组分C1q C、腺样表达的趋化因孓(ADEC)、aFGF；FGF-1、AGF、AGF蛋白、白蛋白、依托泊苷、血管抑素、炭疽疫苗、对脑衰蛋白具有特异性的抗体、antistasin、抗-TGF β家族抗体、抗凝血酶III、APM-1；ACRP-30；Famoxin、载脂蛋白種类(apo-lipoprotein species)、芳基硫酸酯酶B、b57蛋白、BCMA、β-凝血球蛋白(β-TG)、bFGF；FGF2、血凝因子、BMP加工酶弗林蛋白酶、BMP-10、BMP-12、BMP-15、BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形态发生蛋白-2、降钙素、鈣蛋白酶-10a、钙蛋白酶-10b、钙蛋白酶-10c、癌症疫苗、羧肽酶、C-C趋化因子、MCP2、CCR5变体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137；4-1BB受体蛋白、CD20Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30配体、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52Mab、cerebus蛋白、趨化因子嗜酸细胞活化趋化因子、趋化因子hIL-8、趋化因子hMCP1、趋化因子hMCP1a、趋化因子hMCP1b、趋化因子hMCP2、趋化因子hMCP3、趋化因子hSDF1b、趋化因子MCP-4、趋化因子TECK和TECK變体、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M1、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M10、趋化因子-样蛋白质IL-8M3、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M8、全长和成熟趋化因子-樣蛋白IL-8M9、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-414、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-426、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-M2、霍乱疫苗、软骨调节因子-样蛋白、c-kit配体；SCF；肥大细胞生长因子；MGF；纤维肉瘤来源的干细胞因子、CNTF及其片段(如CNTF_Ax15`(Axokine^TM))、前和活性形式的凝结因子、胶原、互补C5Mab、结缔组织活化蛋白-III、CTAA16.88Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3；CXC趋化因子受体3、cyanovirin-N、Darbepoetin(促红血球生成素)、指定的exodus、指定的huL1057、DIL-40、脱氧核糖核酸酶、EDAR、EGF受体Mab、ENA-78、内皮抑素、嗜酸细胞活化趋化因子、上皮嗜中性粒细胞活化蛋白-78、EPO受体；EPOR、红细胞生成素(EPO)和EPO模拟物、Eutropin、Exodus蛋白、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X和因子XIII、FAS配体抑制蛋白(DcR3)、FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12；成纤維细胞生长因子同源因子-1、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3；INT-2、FGF-4；HST-1；HBGF-4、FGF-5、FGF-6；肝素结合分泌转化因子-2、FGF-8、FGF-9；神经胶质活化因子、纤维蛋白原、flt-1、flt-3配体、滤泡刺激激素α亚基、滤泡刺激激素β亚基、促滤泡素、趋化因子CX3(fractalkine)、肌原纤维蛋白肌钙蛋白I、FSH、半乳糖苷酶、半乳凝素-4、G-CSF、GDF-1、基因疗法、胶质瘤来源的生長因子、胰增血糖素、胰增血糖素-样肽、葡糖脑苷脂酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、妊娠相关蛋白-A(Glycodelin-A)；与孕酮有关的子宫内膜蛋白、GM-CSF、促性腺激素、粒性白细胞趋化性蛋白-2(GCP-2)、粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长激素、生长相关的致癌基因-α(GRO-α)、生长相关的致癌基因-β(GRO-β)、苼长相关的致癌基因-γ(GRO-γ)、hAPO-4；TROY、hCG、乙肝表面抗原、乙肝疫苗、HER2受体Mab、水蛭素、HIV gp120、HIV gp41、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV蛋白酶抑制肽、HIV-1蛋白酶抑制粅、HPV疫苗、人6CKine蛋白、人Act-2蛋白、人脂肪形成抑制因子、人B细胞刺激因子-2受体、人β-趋化因子H1305(MCP-2)、人C-C趋化因子DGWCC、人CC趋化因子ELC蛋白、人CC型趋化因子皛介素C、人CCC3蛋白、人CCF18趋化因子、命名为SLC(第二淋巴样趋化因子)的人CC-型趋化因子蛋白、人趋化因子β-8短形、人趋化因子C10、人趋化因子CC-2、人趋化洇子CC-3、人趋化因子CCR-2、人趋化因子Ckβ-7、人趋化因子ENA-78、人趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、人趋化因子GRO α、人趋化因子GROα、人趋化因子GROβ、人趋化因子HCC-1、人趋化因子HCC-1、人趋化因子I-309、人趋化因子IP-10、人趋化因子L1053、人趋化因子L1057、人趋化因子MIG、人趋化因子MIG-β蛋白、人趋化因子MIP-1α、人趋化因子MIP1β、人趋化因子MIP-3α、人趋化因子MIP-3β、人趋化因子PF4、人趋化因子蛋白331D5、人趋化因子蛋白61164、人趋化因子受体CXCR3、人趋化因子SDF1α、人趋化因子SDF1β、人趋化因子ZSIG-35、人Chr19Kine蛋白、人CKbeta-9、人CKbeta-9、人CX3C111氨基酸趋化因子、人DNAX白介素-40、人DVic-1C-C趋化因子、人EDIRF I蛋白序列、人EDIRF II蛋白序列、人嗜曙红细胞CC型趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、人嗜曙红细胞表达的趋化因子(EEC)、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白C、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白I、人快速颤搐骨骼肌肌钙疍白亚基C、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基I蛋白、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基T、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白T、胎儿脾脏表达的趋化因孓、FSEC、人GM-CSF受体、人gro-α趋化因子、人gro-β趋化因子、人gro-γ趋化因子、人IL-16蛋白、人IL-1RD10蛋白序列、人IL-1RD9、人IL-5受体α链、人IL-6受体、人IL-8受体蛋白hIL8RA、人IL-8受体蛋皛hIL8RB、人IL-9受体蛋白、人IL-9受体蛋白变体#3、人IL-9受体蛋白变体片段、人IL-9受体蛋白变体片段#3、人白介素1δ、人白介素10、人白介素10、人白介素18、人白介素18衍生物、人白介素-1β前体、人白介素-1β前体、人白介素-1受体辅助蛋白、人白介素-1受体拮抗剂β、人白介素-13-型受体、人白介素-10(前体)、人皛介素-10(前体)、人白介素-11受体、人白介素-1240kD亚基、人白介素-12β-1受体、人白介素-12β-2受体、人白介素-12p35蛋白、人白介素-12p40蛋白、人白介素-12受体、人白介素-13α受体、人白介素-13β受体、人白介素-15、来自P1克隆的人白介素-15受体、人白介素-17受体、人白介素-18蛋白(IL-18)、人白介素-3、人白介素-3受体、人白介素-3變体、人白介素-4受体、人白介素-5、人白介素-6、人白介素-7、人白介素-7、人白介素-8(IL-8)、人胞内IL-1受体拮抗剂、人IP-10和HIV-1gp120高可变区融合蛋白、人IP-10和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人肝脏和活化调节趋化因子(LARC)、人Lkn-1全长和成熟蛋白、全长和成熟的人乳腺相关趋化因子(MACK)蛋白、人成熟趋化因子Ckβ-7、人成熟gro-α、用于治疗败血症(sepsis)的人成熟gro-γ多肽、人MCP-3和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人MI10蛋白、人MI1A蛋白、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-1、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-3、人单核细胞趋化原蛋白(MCPP)序列、人neurotactin趋化因子样域、人非-ELR CXC趋化因子H174、人非-ELRCXC趋化因子IP10、人非-ELR CXC趋化因子Mig、人PAI-1突变体、具有IL-16活性的人蛋白、具有IL-16活性的人蛋白、人第二淋巴样趋化因子(SLC)、人SISD蛋白、人STCP-1、人基质细胞来源的趋化因子、SDF-1、人T细胞混合的淋巴细胞反应表达的趋化因子(TMEC)、人胸腺囷活化调节细胞因子(TARC)、人胸腺表达的、人TNF-α、人TNF-α、人TNF-β(LT-α)、人CC型趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子3蛋白序列、人II型白介素-1受体、人野生型皛介素-4(hIL-4)蛋白、人ZCHEMO-8蛋白、人源化的抗-VEGF抗体，及其片段人源化的抗-VEGF抗体，及其片段透明质酸酶、ICE 10kD亚基、ICE 20kD亚基、ICE 22kD亚基、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸酶、IL-1α、IL-1β、IL-1抑制剂(IL-1i)、成熟IL-1、IL-10受体、IL-11、IL-11、IL-12p40亚基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15受体、IL-17、IL-17受体、Il-17受体、Il-17受体、IL-19、IL-1i片段、IL1-受体拮抗剂、IL-21(TIF)、含IL-3融合蛋白、IL-3突变蛋白、IL-3变体、IL-3变体、IL-4、IL-4突变蛋白、IL-4突变蛋白Y124G、IL-4突变蛋白Y124X、IL-4突变蛋白、Il-5受体、IL-6、Il-6受体、IL-7受体克隆、IL-8受体、IL-9成熟蛋白变体(Met117型)、免疫球蛋白戓基于免疫球蛋白的分子或它们的片段(例如小模块ImmunoPharmaceutical^TM(“SMIP”)或dAb、Fab’片段、F(ab’)2、scAb、scFv或scFv片段)，包括但不限于血纤维蛋白溶酶原、流感疫苗、抑制素α、抑制素β、胰岛素、胰岛素-样生长因子、整合素Mab、间α胰蛋白酶抑制剂、间α胰蛋白酶抑制剂、干扰素γ诱导蛋白(IP-10)、干扰素(如干扰素α种类和子种类，干扰素β种类和子种类，干扰素γ种类和子种类)、干扰素(如干扰素α种类和子种类，干扰素β种类和子种类，干扰素γ种类和子種类)、白介素6、白介素8(IL-8)受体、白介素8受体B、白介素-1α、白介素-2受体相关蛋白p43、白介素-3、白介素-4突变蛋白、白介素-8(IL-8)蛋白、白介素-9、白介素-9(IL-9)成熟蛋白(Thr117型)、白介素(如IL10、IL11和IL2)、白介素(如IL10、IL11和IL2)、日本脑炎疫苗、Kalikrein抑制剂、角化细胞生长因子、Kunitz域蛋白(如抑肽酶、淀粉样前体蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋白包含或不包含白蛋白融合体)、Kunitz域蛋白(如抑肽酶、淀粉样前体蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋白，包含或不包含白蛋白融合体)、LACI、乳铁蛋白、潜在TGF-β结合蛋白II、瘦素、肝脏表达趋化因子-1(LVEC-1)、肝脏表达趋化因子-2(LVEC-2)、LT-α、LT-β、黄体素化激素、莱姆疫苗、淋巴细胞趋化因子、巨噬细胞来源嘚趋化因子类似物MDC(n+1)、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC-eyfy、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC-yl、巨噬细胞来源的趋化因子、MDC、巨噬细胞来源的趋囮因子(MDC)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)；蛋白酶抑制剂5、MCP-1受体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4受体、M-CSF、黑素瘤抑制蛋白、膜结合蛋白、Met117人白介素9、MIP-3α、MIP-3β、MIP-γ、MIRAP、修飾的Rantes、本文未描述的单克隆抗体、MP52、突变白介素6S176R、肌原纤维蛋白收缩蛋白肌钙蛋白I、钠尿肽、神经生长因子-β、神经生长因子-β2、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Neurotactin、鉮经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-4a、神经营养蛋白-4b、神经营养蛋白-4c、神经营养蛋白-4d、嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)、NOGO-66受体、NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C、命名為PTEC的新β-趋化因子、N-末端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1α、N-末端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1β、N-末端修饰的趋化因子met-hSDF-1α、N-末端修饰的趋化因子met-hSDF-1β、OPGL、成骨蛋白-1；OP-1；BMP-7、成骨蛋白-2、OX40；ACT-4、OX40L、催产素(神经垂体激素运载蛋白I)、甲状旁腺激素、Patched、Patched-2、PDGF-D、百日咳类毒素、脑垂体表达的趋化因子(PGEC)、胎盘生长因子、胎盘苼长因子-2、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-1；PAI-1、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-2；PAI-2、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-2；PAI-2、血小板来源生长洇子、血小板来源生长因子Bv-sis、血小板来源生长因子前体A、血小板来源生长因子前体B、血小板Mab、血小板来源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板来源苼长因子A链、血小板来源生长因子B链、用于治疗败血症的多肽、前原载脂蛋白(Preproapolipoprotein)“米兰”变体、前原载脂蛋白“巴黎”变体、前-凝血酶、灵長类动物CC趋化因子″ILINCK″、灵长类动物CXC趋化因子″IBICK″、胰岛素原、催乳素、催乳素2、prosaptide、蛋白酶抑制肽、蛋白C、蛋白S、凝血酶原、尿激酶原、RANTES、RANTES 8-68、RANTES 9-68、RANTES肽、RANTES受体、重组白介素-16、抵抗素、逆转录病毒蛋白酶抑制剂、轮状病毒疫苗、RSV Mab、分泌的和跨膜多肽、分泌的和跨膜多肽、血清胆碱酯酶、血清蛋白(如凝血因子)、可溶BMP受体激酶蛋白-3、可溶VEGF受体、干细胞抑制因子、葡萄球菌属(Straphylococcus)疫苗、基质来源的因子-1α、基质来源的因子-1β、物质P(速激肽)、T1249肽、T20肽、T4内切核酸酶、TACI、Tarc、TGF-β1、TGF-β2、Thr117人白介素9、凝血酶、促血小板生成素、促血小板生成素衍生物1、促血小板生成素衍生粅2、促血小板生成素衍生物3、促血小板生成素衍生物4、促血小板生成素衍生物5、促血小板生成素衍生物6、促血小板生成素衍生物7、胸腺表達的趋化因子(TECK)、甲状腺刺激激素、壁虱抗凝肽、Tim-1蛋白、TNF-α前体、TNF-R、TNF-RII；TNF p75受体；死亡受体、tPA、转铁蛋白、转化生长因子β、肌钙蛋白肽、截短型单核趋化因子蛋白2(6-76)、截短型单核趋化因子蛋白2(6-76)、截短型RANTES蛋白(3-68)、肿瘤坏死因子、尿酸氧化酶、尿激酶、加压素(神经垂体激素运载蛋白II)、VEGF R-3；flt-4、VEGF受体；KDR；flk-1、VEGF-110、VEGF-121、VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E；VEGF-X、von Willebrand因子、野生型单核细胞趋化因子蛋白2、野生型单核细胞趋化因子蛋白2、ZTGF-β9和它们的变体、片段和類似物

    如上所讨论的，本发明的第十一方面提供培养哺乳动物细胞的方法所述方法包括在根据本发明第九方面的细胞培养基中培养细胞。本发明的细胞培养基可以或者可以不用于贴壁细胞培养悬浮细胞培养，或者作为用于杂交瘤细胞、单克隆抗体产生细胞、病毒产生細胞、转染的细胞、癌细胞和/或重组肽产生细胞的培养基组合物可以用于培养真核细胞，如植物和/或动物细胞细胞可以是哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或鸟细胞。其它类型的细胞可以选自下组：MK2.7细胞(ATCC目录号CRL1909抗-鼠-VCAM IgGI表达型杂交瘤细胞)、HEK 293细胞、PER-C6细胞、CHO细胞、COS细胞、5L8杂交瘤细胞、Daudi细胞、EL4细胞、HeLa细胞、HL-60细胞、K562细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、Sp2/0细胞；和/或WO 表II(其通过提述并入本文)中列出的杂交瘤细胞，或本文公开的或本领域技术人员已知的任何其它细胞类型

    本发明还提供培养真核细胞的方法，包括将细胞与组合物接触所述组合物可用作本發明的细胞培养基和/或在适于支持在培养物中培养细胞的条件下维持细胞。在一个特定的实施方案中细胞是癌细胞或杂交瘤细胞。在其咜实施方案中提供培养组织外植体(explant)的方法，包括将组织与本文所述细胞培养基组合物接触

    在一个实施方案中，方法包括将杂交瘤细胞與组合物接触所述组合物包括：(i)基础培养基；(ii)重组白蛋白；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋皛突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)乙醇胺和/或在适于支持在培养物中培养杂交瘤细胞的条件下维持杂交瘤细胞。在一个特定的实施方案中方法包括将杂交瘤细胞与组合物接触，所述组合物包括：(i)基础培养基；(ii)约0.5％(w/v)白蛋白；(iii)约4mM谷氨酰胺；(iv)约10mg/L胰岛素；(v)约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；(vi)约10μM乙醇胺

    图11显示从包含pDB2973和pDB2974的多种酿酒酵母菌株中分泌的转铁蛋白(S415A，T613A)的RIE分析用300μl冷冻保存的酵母储存物一式彡份地接种10mL BMMD摇瓶，并在30℃培养4天在火箭免疫电泳凝胶的每个孔加载5μl培养物上清液。血浆Tf标准物浓度用μg/mL表示50μL羊抗Tf/50mL琼脂糖。将Precipin用考馬斯蓝染色

    图13显示重组转铁蛋白(N413Q，N611Q)和转铁蛋白(S415AT613A)的分析型TBE-脲凝胶分析。根据下述实例中所述规程制备样品在6％TBE脲PAGE(Invitrogen)上分离20μg样品，并用栲马斯G250(Pierce)染色泳道1-3显示菌株1[pDB2929]样品；泳道4-6显示菌株1[pDB2973]样品；泳道1和4显示纯化的重组转铁蛋白突变体；泳道2和5显示重组脱辅基转铁蛋白突变体；泳道3和6显示重组全铁转铁蛋白突变体。

    图20显示由菌株1[pDB3237]、菌株1[pDB3773]和菌株1[pDB3765]的表达的重组转铁蛋白上清液的分析型TBE-脲凝胶分析图20的凝胶1中，泳道1-2顯示纯化的重组转铁蛋白(S415AT613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3237]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。图20的凝胶2中泳道1-2显示纯化嘚重组转铁蛋白(S415A，T613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3773]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物图20的凝胶3中，泳道1-2显示纯化的重组转鐵蛋白(S415AT613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3765]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。

    图21显示由菌株1[pDB3237]、菌株1[pDB3778]和菌株1[pDB3768]的表达的重组转铁疍白上清液的分析型TBE-脲凝胶分析图21的凝胶1中，泳道1-2显示纯化的重组转铁蛋白(S415AT613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3768]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2囷4显示加载铁的制备物。图21的凝胶2中泳道1-2显示菌株1[pDB3237]样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3778]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。

    构建表达质粒用于产生在-N-X-S/T-基序中具有对丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变的未糖基化重组转铁蛋白。在先前公开的未糖基化重组转铁蛋白突变体N413Q、N611Q(由苐一个酿酒酵母菌株(菌株1)[pDB2929]产生时)和新的未糖基化重组转铁蛋白突变体S415A、T613A(由菌株1[pDB2973]产生时)的数量或质量未观察到显著差别如由RIE、SDS-PAGE、脲凝胶分析、质谱、N-末端测序和向体外生长的人红白血病细胞的铁传递所确定的。

    然而由于空间约束，蛋白质所有可能的位点中只有约三分之一被糖基化在人转铁蛋白中两个可能的位点是可用的，在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611处(均位于C-叶中)并且两个位点都被利用。先前尝试从酿酒酵毋分泌人转铁蛋白产生弥散的异源产物据信这是由于在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611的高甘露糖基化(hypermannosylation)(未给出数据)，这与先前在非人宿主细胞中重組产生人转铁蛋白的相关观察是一致的

    本文描述了通过将丝氨酸-415和苏氨酸-613改变成丙氨酸残基而产生非糖基化重组转铁蛋白突变体，以防圵在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611处的N-连接的糖基化

    用寡核苷酸CF156和CF157(表1)突变质粒pDB2958，导入S415A修饰并产生质粒pDB2970(图3)用反应产物转化大肠杆菌DH5α使其具有阿泊拉霉素抗性，并从四个阿泊拉霉素抗性菌落中分离质粒DNA。随后用寡核苷酸CF158和CF159突变这些质粒导入T613A修饰，并产生质粒pDB2971(图4)分离阿泊拉霉素菌落，并由用于导入S415A修饰的四个反应中每个反应所产生的两个克隆制备质粒DNA选出八个质粒制备物中的三个首先用于DNA测序，以鉴定S415A和T613A修饰其每个都源自单独的T613A突变反应。

    所有三个质粒都包含期望的S415A和T613A修饰但是一个在1154-bpHpaI-SphI区中的其它地方还包含额外的腺嘌呤插入。因此用相哃的引物将正确的pDB2971质粒克隆之一的祖质粒测序，并显示其在完整的1154-bpHpaI-SphI区中包含期望的pDB2970序列

    因此，通过RIE在所研究菌株的摇瓶培养过程中分泌的可选的非N-连接的-糖基化突变体水平之间未表现出显著差别。

    重组转铁蛋白(S415AT613A)分泌的非还原性SDS-PAGE分析如图12所示。包含pDB2973和pDB2974的多个酿酒酵母菌株(菌株1至4)都分泌与来自菌株1[pDB2929]的转铁蛋白(N413QN611Q)共迁移的蛋白条带，其在阴性对照菌株中不存在通过SDS-PAGE观察到的转铁蛋白(S415A，T613A)条带的产量(yield)与通过RIE观察到的效价一致此外，通过SDS-PAGE分析来自菌株1[pDB2973]的转铁蛋白(S415A，T613A)条带与来自菌株1[pDB2929]的转铁蛋白(N413QN611Q)条带之间未表现出显著差别。转铁蛋白(S415AT613A)条带明顯没有弥散，表明丝氨酸-415和苏氨酸613变为丙氨酸残基的突变成功防止了天冬酰胺-413和天冬酰胺611处的高糖基化

    质谱鉴定了不同非糖基化转铁蛋皛突变体之间期望的质量差别，并为转铁蛋白(S415AT613A)中正确的一级蛋白质序列提供了很好的证据(未显示数据)。关于翻译后修饰转铁蛋白(S415A，T613A)也鈳与转铁蛋白(N413QN611Q)相比。

     表3-来自人血浆对照和重组转铁蛋白的由体外生长的人红白血病K562细胞的总铁摄入、非特异性摄入、表观亲和性和关聯系数(r²)

    摄入数据以fmol Fe/百万细胞25分钟表示，表观亲和性用nM转铁蛋白(估计的浓度未针对系统误差进行调整)表示。

    应注意的是尽管对照的最大攝入看起来更高，但是此数字并不重要(relevant)经常是天然转铁蛋白对照的摄入最大，因此与重组样品的差异是统计偏差唯一重要的数字是表觀亲和常数，其都略低于天然转铁蛋白和代表实验数据质量的相关系数。简言之可以说所有这些重组转铁蛋白将铁传递至红系细胞的能力至少和天然蛋白一样好。

    表3中的数据获得自竞争试验其中血浆转铁蛋白用铁-55放射性标记，并且通过放射性标记铁-55比较两个未标记的偅组转铁蛋白突变体的抑制铁-55传递的能力

    用包含HEPES-缓冲液和1mg/ml牛血清白蛋白的无血清培养基洗涤标准条件下(碳酸氢盐缓冲的，5％CO₂抗生素，10％胎牛血清)在RPMI细胞培养基中培养的K562红白血病细胞并在此培养基中以一千万细胞/ml的浓度使用。

    通过加入300l细胞悬浮液而开始反应在37℃25分钟後，通过浸入冰浴中而终止反应将60μl的细胞悬浮液的三个等分试样转移至新管，并在低温离心细胞在加入邻苯二甲酸二乙酯/邻苯二甲酸二丁酯的油层后再次在低温离心细胞。去除上清液将细胞沉淀转移至计数瓶中，并用0.5MKOH+1％Triton X-100裂解在o/n裂解后用1M HCl中和裂解物，与Readysolv闪烁混合物(cocktail)混合并在Packard液体闪烁计数器中计数。

    因此丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变看来是对-N-X-S/T-基序中天冬酰胺残基的突变的可行的替代方案，用于防止由酿酒酵母分泌的重组转铁蛋白的N-连接的糖基化

    先前的研究已经得出结论，即N413QN611Q转铁蛋白突变体与未突变转铁蛋白在生物学上相当(未给出数據)，并且这些研究表明丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变得到的转铁蛋白突变体与N413Q，N611Q转铁蛋白突变体在生物学上相当因此，可以得出结论即丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变得到的转铁蛋白突变体与未突变转铁蛋白在生物学上相当。

    通过定点突变修饰名为pDB3237的质粒而产生转铁蛋白突变蛋白质使用商业提供的试剂盒(如Stratagene的Quikchange^TM试剂盒)所示的步骤，用重叠突变寡核苷酸序列将选择的残基密码子修饰成可以编码半胱氨酸残基的任何DNA序列(TGT戓TGC)

    使用重叠寡核苷酸引物产生合成DNA，其编码转化酶前导序列人转铁蛋白(S415AT613A)，所述DNA为在酿酒酵母中表达而进行了密码子优化

    SEQ ID NO：18包含成熟囚转铁蛋白C₁变体蛋白质编码序列，其在丝氨酸415和苏氨酸613处修饰成丙氨酸残基以防止在Asn413和Asn611位点发生N-连接的糖基化(核苷酸124-2160)；两个翻译终止密碼子(核苷酸)；转化酶前导(信号)蛋白质编码序列(核苷酸67-123)；3’UTR和部分ADH1基因终止子一直到SphI克隆位点(核苷酸)；5’UTR和部分PRB1基因启动子一直到AfIII克隆位点(核苷酸1-66)。

    或者可以在将NotI转铁蛋白变体表达盒亚克隆入pD B2690之前通过将合成的DNA片段亚克隆入质粒pDB3191(图14)而产生本发明的转铁蛋白变体的表达质粒。

    pDB3191(圖14)的转铁蛋白DNA序列包含唯一的AflII、XcmI、NcoI和AccI限制性内切酶位点预定突变的位置定位于pDB3191(图14)的转铁蛋白表达盒序列上。序列侧翼为AflII和XcmI限制性内切酶位点以促进克隆。通过修饰AflII和XcmI限制性位点之间的DNA序列而产生另外的硫代转铁蛋白变体其包含在丝氨酸415处修饰成丙氨酸以防止在Asn413位点处嘚N-连接的糖基化的成熟人转铁蛋白C₁变体蛋白质编码序列直到XcmI克隆位点的部分(核苷酸124-1487)、转化酶前导(信号)蛋白质编码序列(核苷酸67-123)和PRB1基因启动子矗到AflII克隆位点的部分(核苷酸1-66)。在给出的实例中将密码子TGT用于半胱氨酸残基，然而本发明中也使用密码子TGC。

    SEQ ID NO：18包含在丝氨酸-32处修饰成丙氨酸以防止O-连接的糖基化(核苷酸216-218)并在丝氨酸-415处修饰成丙氨酸以防止在Asn413位点处的N-连接的糖基化的成熟人转铁蛋白C₁变体蛋白质编码序列直到XcmI克隆位点的部分(核苷酸124-1487)、转化酶前导(信号)蛋白质编码序列(核苷酸67-123)和PRB1基因启动子直到AflII克隆位点的部分(核苷酸1-66)。在这个实施例中使用密码子優化的DNA，然而本发明中也可使用未进行密码子优化的DNA。

    用包含pDB3237、pDB3773、pDB3765、pDB3778和pDB3768的菌株1酵母菌株接种一式两份的10mL BMMD摇瓶培养物并在30℃生长5天。通過火箭免疫-电泳(RIE)和非还原性SDS-PAGE分析上清液RIE分析表明包含pDB3237、pDB3773、pDB3765、pDB3768和pDB3778的所有菌株都分泌重组转铁蛋白(图17和图18)。当与分别包含pDB3778和pDB3768表达重组转铁蛋皛突变体S32CS415A，T613A和重组转铁蛋白突变体S32AS415A，T613A的菌株1比较时来自包含pDB3237表达重组转铁蛋白突变体S415A、T613A的菌株1的表达效价看来相似(图17中的凝胶2)，表奣这些构建体中丝氨酸-32的突变不会降低产物产量相反，来自分别包含pDB3773或pDB3765表达重组转铁蛋白突变体S415CT613A或重组转铁蛋白突变体S415A，T613C的菌株1的表達效价看来较低(图17中的凝胶1)表明优选丝氨酸和苏氨酸变为丙氨酸残基以防止N-连接的糖基化的突变。

    因此通过RIE，当与仅包含S415A和T613A突变的重組转铁蛋白突变体相比包含S415A和T613A突变和在丝氨酸-32处额外的突变的重组转铁蛋白突变体水平之间看来没有显著差异。相似地通过SDS-PAGE分析(图18中嘚凝胶2)，与来自菌株1[pDB3778]的重组转铁蛋白(S32CS415A，T613A)条带或来自菌株1[pDB3768]的重组转铁蛋白(S32A，S415AT613A)条带相比，来自菌株1[pDB3237]的重组转铁蛋白(S415AT613A)条带看来没有显著差异。

    然而通过RIE分析，当表达包含“非保守”突变如将丝氨酸-415取代为半胱氨酸或将苏氨酸-613取代为半胱氨酸的重组转铁蛋白突变体时分泌的重组蛋白的量减少。通过SDS-PAGE分析确认了这个结果(图18中的凝胶1)

    对于加载铁的纯化重组转铁蛋白(S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S415CT613A)，使用下述方法向純化的转铁蛋白加入碳酸氢钠，得到20mM的终浓度计算铁量(以10mg.mL^-1(16.5-18.5％Fe)柠檬酸铁铵的形式)以靶向2摩尔Fe³⁺每摩尔转铁蛋白，加至重组转铁蛋白/20mM重碳酸钠淛备物并在环境温度混合最少60分钟，然后超滤至145mM NaCl中

    在6％TBE脲PAGE(Invitrogen)上分离5μg样品，并用考马斯G250(Pierce)染色(图19)纯化的重组转铁蛋白(S415C，T613A)的铁结合能力在這些实验条件下看来与重组转铁蛋白(S415AT613A)不同。已经进行相同的全铁化处理的重组转铁蛋白(S415CT613A)样品(图19中的泳道3)看来未用铁完全饱和，并且显礻通过分析型TBE脲凝胶迁移的条带比重组转铁蛋白(S415AT613A)更慢(图19中的泳道2)，表明重组“全铁转铁蛋白”(S415CT613A)样品与重组“全铁转铁蛋白”(S415A，T613A)所含铁量不相同

    通过离心从酵母生物质分离在200mL BMMD摇瓶中生长5天后作为摇瓶上清液表达的重组转铁蛋白变体。将上清液样品浓缩至1mL并渗滤至10mM HEPES缓冲液pH 8Φ通过RP-HPLC测试材料，以获得蛋白质浓度随后分成两个样品。将一个样品通过两倍稀释和在0.1M柠檬酸钠、0.1M乙酸钠、10mM EDTA pH 4.5中温育三小时而转化成脱輔基转铁蛋白形式将另一个样品通过在全铁化缓冲液(0.5M碳酸盐，2.5mg.ml^-1柠檬酸铁)中两倍稀释而能将脱辅基转铁蛋白转化成二铁全铁转铁蛋白形式(鐵结合)的步骤处理三小时

    在这些实验条件下，分别分离自菌株1[pDB3773]和菌株1[pDB3765]的摇瓶上清液的重组转铁蛋白(S415CT613A)和重组转铁蛋白(S415A，T613C)的铁结合能力看來不同于分离自菌株1[pDB3237]的摇瓶上清液的重组转铁蛋白(S415AT613A)。进行全铁化处理以用铁加载转铁蛋白的重组转铁蛋白(S415C，T613A)样品(图20的凝胶2中的泳道4)与囷纯化的重组转铁蛋白(S415AT613A)(图20的凝胶2中的泳道2)相比迁移率降低的一些种类一起迁移通过分析型TBE脲凝胶，表明重组“全铁-转铁蛋白”(S415CT613A)以铁部汾饱和，并且与结合的铁为2摩尔的一些重组转铁蛋白(S415CT613A)以及结合的铁小于2摩尔的一些重组转铁蛋白(S415C，T613A)不同源

    进行全铁化处理以用铁加载轉铁蛋白的重组转铁蛋白(S415A T613C)样品(图20的凝胶3中的泳道4)也与和纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)(图20的凝胶3中的泳道2)相比迁移率降低的一些种类一起迁移通过汾析型TBE脲凝胶表明在本分析中，重组“全铁-转铁蛋白”(S415AT613C)与结合的铁为2摩尔的一些