摘要 shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病蝳 在Marc145细胞中复制的研究 摘要 猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Prcinereproductive。nd:spi:atorysyndrooe virus，PRRSV) 属于尼多病毒目动脉炎病毒科它主要引起母猪早产、流产等繁殖障 碍，仔豬、育肥猪呼吸困难及育成猪类流感疾病此外该病毒持续性感染，可引起免 疫抑制成为危害世界养猪业安全的重要病原之一。然而目前疫苗的使用只能够提 供部分保护使机体不再出现临床症状，不能够阻止感染因此，迫切需要开发一种新 型的、能对所有PRRSv病毒株提供保护的杭病毒措施 NRA干扰是由双链RNA(dsRNA)引发的信使RNAm〔RNA)序列特异性消减现象，是一 种保守的杭病毒机制已发现于线虫、植物和哺乳动物中。将 21┅23nt 的小分子千 扰RN人双链 (smallinterferenceRNAsiRNA)或载体。NA转录的发夹RN^ (h。rt hairPinNRAsshRNAs〕导入细胞，可以抑制同源的内源或病原mNRA的表达近几年， RN从技术已被用于千扰HRV、HCv、鋶感 和其他人类病毒的感染研究提示RN人1作 为一个有效的杭病毒策略，具有很大应用前景但是目前对于PRRsv是否存在RNA干 扰现象，究竟哪些基洇哪些序列是合适的靶标shRNA对 PRRSv抑制有哪些特征等等， 尚没有这方面的研究. 为了探讨pSUPER质粒能否有效表达发夹小干扰RNA(shRNA)作为RNAi研究的平 台，本研究利用RNA干扰技米以A型流感病毒核衣壳蛋白(NP)基因为靶基因，选用已 知的有高效抑制效果的siRNA片段设计有小发夹结构的两条寡核普酸序列，經退火 成互补双链再克隆至质粒pSUPER 中，经酶切鉴定和测序证实表达质粒构建成功命 名为psuPER一NP。将该表达质粒转染鸡胚成纤维细胞 (cFE)2h4后用人型流感病毒 感染，病毒感染4h0后观察细胞病变测定病毒血凝效价和Tc1D，，发现psuPER一即 能够阻止细胞病变的出现pSUPER一NP转染孔的血凝价和TC工D，均显著下降，表明该 表达质粒能抑制流感病毒的复制pSUPER质粒可以应用于哺乳动物高效的RNAi研究， 也为探索流感病毒致病机理和开发基因治疗噺途径莫定了基础 RNAi抑制效果的正确评价，需要合适的检测方法为了建立灵敏、快速的毗NA 检测方法，本研究设计合成了一套引物和Ta咖an探針以扩增猪繁殖与呼吸综合征 病毒的核衣壳蛋白基因，通过反应条件的优化建立了快速定量检测猪繁殖与呼吸综 合征病毒的实时PCR方法，并用该法检测患病猪的肺脏等样品结果表明该方法具有 较好的特异性和重复性，对PRRSV细胞培养物的检测下限为0.01TCDIS，敏感性比常 博士学位論文:hsRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Mrac 145细胞中复制的研究 规TR一PCR高1o0倍;对01份PRRs疑似猪肺脏样品检侧5份为阳性与病毒分离的 阳性符合率为10叽 该方法具有快速、灵敏、准确、低污染等优点，在PRRvs的早期 检测、预防控制、进出口检疫及基础研究中会起到重要作用 转染效率低是阻碍SIRNA介导的基因沉默效果的重要因素，为了实现质粒在 Ma:cl45细胞中的最佳转染本研究以荧光质粒pEGFP为报告质粒，通过对转染试剂 的选择、脂质体质粒比例、细胞密度和最佳质粒转染量的优化确定了质粒转染 Marc145细胞的最佳转染条件，即转染前42h将96孔板每孔铺1个‘细胞，转染前h4 将细胞换液转染时TransFast租TransfectionReagent与质粒比单L/卜9)为3:1， 每孔转染0.4卜9的pEGFp(24孔板每孔1.0鲜9)时转染孔的荧光数最多，荧光强度 最大转染效率最高，从而为下一步的:hRNA表达质粒高效转染Mar415细胞英定了 基石出，

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